Чтение онлайн

Рис. 5. Зависимость от температуры константы скорости депуринизации ДНК in vitro и образования суммы апуриновых участков и разрывов ДНК in vivo: I — выщепление аденина (·) и гуанина (x) из ДНК тимуса теленка в Na-цитратном буфере при значении ионной силы несколько большей физиологической и рН 6,8 и депуринизация ДНК бактерий (точка 1) или ДНК фага Т7 (точка 2) при значениях ионной силы и рН, близких к физиологическим условиям; точки 3 и 4 — образование тепловых повреждений ДНК in vivo соответственно, в клетках грызунов и в культивируемых фибробластах человека; II — выщепление аденина или гуанина (+) из лиофильно высушенной ДНК тимуса теленка

Известные физико-химические свойства ДНК таковы, что кривую можно продолжить (экстраполировать) до значений абсциссы, соответствующей температуре 37°. Рассчитанная нами таким методом константа скорости депуринизации близка к значению 11– 10 в секунду. Это означает, что из ДНК при физиологических условиях (т. е. при значениях температуры, рН и ионной силы, близких к таковым в клетках) каждую секунду в расчете на 1010 оснований должно теряться примерно одно основание.

Подробный теоретический анализ данных, касающихся организации ДНК в клетке и условий ее существования там, позволяет заключить, что выщепление пуриновых оснований из ДНК клетки происходит со скоростью, довольно близкой к той, которую мы рассчитали. Но даже если эта скорость в 10 раз меньше рассчитанной, заключение о вероятном значении в старении депуринизации ДНК при физиологической температуре остается тем же. Приходится только удивляться, каким образом клетки могут длительно существовать при температуре 37°.

Ответить на этот, казалось бы, весьма далекий от проблем "классической" геронтологии вопрос — значит, понять один из основных защитных молекулярных механизмов, выработанных, очевидно, уже на самых ранних этапах эволюции клеток и организмов для поддержания их жизнеспособности. А следовательно, найти подход для поиска факторов, увеличивающих устойчивость организма к старению.

Конечно, особенно интересны количественные данные теплового повреждения ДНК в клетке (in vivo). Определить скорость такого повреждения ДНК при 37 °C до последнего времени было невозможно, так как при этой температуре наряду с возникновением тепловых повреждений ДНК протекает и обратный процесс — залечивания (репарации) этих повреждений (подробнее об этом процессе будет рассказано чуть позже).

Когда же попытались определить повреждения ДНК в клетках млекопитающих при температурах, превышающих 37 °C, но меньше тех, при которых происходит разрушение клеток, никаких повреждений ДНК не зарегистрировали. Их обнаруживали лишь в случае прогревания клеток грызунов при 65 °C. (Константа скорости образования повреждений ДНК при этой температуре была нами рассчитана, и ей соответствует точка 3 на рис. 5.) Таким образом, к началу 80-х годов среди биологов утвердилось мнение, что при температуре меньше 45 °C тепловые повреждения ДНК в клетках млекопитающих если и индуцируется, то в количествах, которые невозможно зарегистрировать.

Однако с помощью усовершенствованного А. Н. Хохловым и мной седиментационного метода анализа ДНК в культивируемых фибробластах человека нам удалось измерить количество повреждений ДНК, индуцируемых в процессе прогревания этих клеток при 44 °C. В эксперименте учитывались два существенных момента. Во-первых, в течение опыта клетки сохраняли жизнеспособность, т. е. можно было считать, что определяется процесс повреждения ДНК в живых клетках. И во-вторых, при температуре 44 °C происходит существенное ингибирование процесса репарации ДНК, а это означает, что при такой температуре аккумулируются тепловые повреждения ДНК.

Рассчитанной на основании полученных нами данных константе скорости образования тепловых повреждений ДНК соответствует точка 4 на рис. 5.

Спустя несколько лет после опубликования этих данных ряд исследователей в США также зарегистрировали повреждения ДНК в клетках млекопитающих, прогретых при температурах меньше 45 °C.

Несмотря на сложность анализа и в то же время его неполноту, можно с большой вероятностью утверждать: константа скорости теплового разрушения структуры ДНК лежит в пределах менее одного порядка, а именно в пределах 6·10– 11 с– 1 до 3·10– 10 с– 1.

Другие пути оценок скоростей спонтанного разрыва связей пуринов с сахарными остатками в ДНК, основанные на анализе механизмов разрывов этих связей, также приводят к значениям их констант при 37 °C, лежащих в этом диапазоне. В том же диапазоне лежат и рассчитанные нами константы скоростей "спонтанного" разрыва полинуклеотидных цепей ДНК при физиологических условиях.

Но каков биологический смысл этих констант? Каким образом их знание приближает нас к пониманию механизмов старения? Без дополнительного количественного анализа ответить на эти вопросы невозможно.

Примерно каждую секунду в геноме каждой клетки человека спонтанно возникает одно повреждение ДНК. Чтобы "воспринять" приведенные константы, оценить значимость, казалось бы, ничтожно малых скоростей спонтанного возникновения в ДНК апуриновых участков и разрывов, рассчитаем число таких повреждений, возникающих в течение часа в геноме клетки человека и сравним эту величину с числом повреждений ДНК, индуцируемых в той же клетке ионизирующим излучением в дозе, вызывающей гибель значительной части облученных клеток. Такое сравнение ценно, и вот почему. Во-первых, основную "массу" повреждений ДНК, индуцируемых ионизирующим излучением, составляют также разрывы полинуклеотидных цепей или участки ДНК, из которых выщеплены пуриновые или пиримидиновые основания. Во-вторых, из многочисленных данных радиобиологии следует, что такого рода повреждения ДНК или их комбинации (в частности, образование из двух однонитевых разрывов, локализованных в комплементарных цепях вблизи друг друга, "полного" (двойного) разрыва двойной спирали ДНК) ответственны за биологические эффекты излучений. И в-третьих, содержание ДНК в нормальной клетке человека существенно не отличается от содержания в нормальных клетках других млекопитающих. Таким образом, наша количественная оценка скорости возникновения тепловых повреждений ДНК в клетках человека и ее значения будет справедлива и для клеток различных млекопитающих.

В геноме каждой клетки возникает одно повреждение ДНК в секунду. Согласно данным различных работ ДНК в каждой диплоидной клетке человека содержится около 7·109 пар оснований. Примерно столько же пар оснований содержится в ДНК соматической клетки других видов плацентарных млекопитающих. Таким образом, в расчете на ДНК диплоидной клетки человека скорость депуринизации можно принять соответствующей выщеплению в течение часа 2500 пуриновых оснований.

Поскольку процесс образования спонтанных однонитевых разрывов, как правило, лимитируется на этапе депуринизации ДНК, то, следовательно, скорость образования спонтанных однонитевых разрывов должна быть такого же порядка, что и скорость депуринизации ДНК. Подчеркнем однако, что сказанное верно лишь в отношении тепловых разрывов ДНК.

Но часть разрывов ДНК возникает в клетке вследствие реакции с ДНК эндогенных метаболитов радикалов ОН· и O2, а также Н2О2, перекисей липидов ионов металлов с переменной валентностью. Кроме того, часть "спонтанных" разрывов ДНК обусловлена "ошибками" в работе ферментов (ДНКаз) и их "незапрограммированным" взаимодействием с ДНК. Таким образом, в зависимости от типа клеток и их физиологического состояния общая частота возникновения "спонтанных" разрывов в ДНК клеток человека, вероятно, в той или иной степени превышает значение 2·103 в час.