Чтение онлайн

Коллеги из Вильнюса тоже продолжали работать в этом направлении и шестого апреля 2012 года отправили в авторитетнейший журнал Cell свою статью о роли CRISPR/Cas9 в иммунном ответе бактерий. Надо сказать, что процесс публикации научных данных в сегодняшней конкурентной среде очень сильно зависит от ненаучных обстоятельств. К сожалению, через шесть дней в публикации статьи было отказано даже без проведения внешней рецензии. Редактор журнала сразу написал авторам, что статья не представляет никакого научного интереса, и даже не обратился к своим коллегам-ученым с просьбой провести экспертизу представленных данных. Двадцать первого мая 2012 года авторы направили те же материалы в другой, как сейчас бы сказали, менее пафосный журнал Proceedings of the National Academy of Sciences (Труды национальной академии наук США), который опубликовал статью четвертого сентября. Увы, Шарпантье и Дудна опережают литовский коллектив на два месяца. Свою аналогичную статью они направили в журнал Science восьмого июня, а уже двадцать восьмого июня статья была не только принята, но и опубликована.

Сегодня нам известен целый ряд важнейших принципов устройства всего живого на нашей планете. Генетический код, то есть буквенный код нашего генома, одинаков — что у человека, что у бактерии. У всех живых существ ДНК состоит из одних и тех же четырех оснований. Принцип кодирования белков один и тот же. Этим универсальным генетическим кодом написаны индивидуальные (персональные, не одинаковые) тексты. Они отличаются последовательностями нуклеотидов, но основной принцип формирования у них одинаков.

И это не просто констатация неких научных фактов. На самом деле из них следует крайне важный для человечества практический вывод. Ученые предположили, что направляющая (guided) РНК, которая распознает генетический текст у бактерии и вируса, должна столь же успешно распознавать те самые полтора десятка букв генетического текста и внутри клетки человека. А если эта РНК так же, как в бактериальной клетке, связана с ферментом Cas9-нуклеазой, то как раз в том месте молекулы ДНК, где произошло распознавание, может быть сделан разрез. В целом ряде публикаций, вышедших в 2012 году, такая возможность подвергалась сомнению. Однако научные статьи, которые появились в самом начале 2013 года, экспериментально подтвердили ее для клеток млекопитающих, в том числе человека. Фермент Cas9-нуклеаза очень точно разрежет нить ДНК именно в том месте, на которое указала направляющая РНК. Это значит, что мы можем вносить разрыв в генетический текст человека, состоящий из трех миллиардов букв, внутри клетки с исключительно большой точностью, а главное — с удивительной простотой.

В начале этой главы мы говорили об инструментах для побуквенного редактирования генетического текста. Упоминали мегануклеазы, нуклеазы типа цинковых пальцев и т. д. Все это сложные белковые молекулы, которые обычно приходится подбирать в каждом случае отдельно и синтезировать искусственно. Для того чтобы создать подобную распознающую белковую молекулу и проверить ее действие, мы должны синтезировать определенную молекулу ДНК, потом синтезировать нужный белок, затем этот белок выделить, почистить, доказать его эффективность. Требования к правильности структуры распознающих белков очень велики, и их создание — достаточно трудоемкий процесс, который занимает до полугода.

Совершенно иные возможности представило человеку открытие иммунной системы бактерий. Всего одна универсальная нуклеаза Cas9 и несколько букв генетического текста нужны для того, чтобы направить или, если хотите, запрограммировать эту нуклеазу на разрезание молекулы ДНК в определенном месте. Остальное делают природные механизмы. Сегодня можно просто, дешево и быстро химически синтезировать короткую последовательность нуклеотидов, необходимую в качестве направляющей РНК.

Сейчас скорость синтеза принципиально не изменилась, но в любом случае часа за два можно синтезировать нужную последовательность ДНК, которая будет кодировать направляющую РНК. Еще день-другой на несложные генно-инженерные манипуляции — и ваша направляющая РНК готова к работе: она находит на ДНК клетки определенный фрагмент генетического текста, который вы задали при ее синтезе, и в этом месте Cas9-нуклеаза производит разрыв ДНК.

В отличие от сложных белок-белковых трехмерных взаимодействий, у нас происходит простое уотсон-криковское взаимодействие двух линейных структур по принципу комплементарности, то есть взаимодополняемости (см. главу 1). Требуется всего-навсего определенная физиологическая концентрация поваренной соли — как в клетке и определенная температура — тридцать семь градусов Цельсия, поскольку именно при этой температуре живут наши клетки. Больше ничего не нужно. Поэтому длительность побуквенного редактирования генома сократилась от шести месяцев до десяти—четырнадцати дней. Просто, дешево и быстро! Благодаря этому, система CRISPR/Cas9 произвела революцию в современных технологиях генной инженерии.

После того как были открыты первые виды микроорганизмов, имеющих адаптивный иммунитет к бактериофагам, ученые стали искать и другие виды бактерий, тоже имеющих подобную систему защиты, и обнаружили их достаточно много. Отчасти эта активность была обусловлена стремлением запатентовать новые типы нуклеаз или принципы функционирования направляющей РНК для последующей возможной коммерциализации, но, как мы видели на примере йогуртов Danone, даже тот интерес, за который платят деньги, быстро приводит к новым научным открытиям и технологическим прорывам.

Системы CRISPR и ферменты, сходные с Cas9-нуклеазой, были обнаружены у очень многих видов бактерий. Оказалось, что они обладают несколько различающимися свойствами в плане распознавания коротких нуклеотидных последовательностей. Это важно, потому что, как мы помним, у человека в геноме три миллиарда букв, и если мы хотим как-то отредактировать генетический текст, резать надо очень точно и в строго определенном месте, то есть необходима специфичность разрезания. Например, если в случае использования CRISPR стрептококка для распознавания посредством направляющей РНК особенно важны только первые три нуклеотида, то в случае стафилококка уже требуется последовательность, в которой особенно важны первые шесть нуклеотидов. Среди трех миллиардов букв генома человека комбинация из трех нуклеотидов еще может найтись, но найти вторую такую же комбинацию из шести нуклеотидов направляющая РНК и фермент Cas9-нуклеаза едва ли сумеют, поэтому специфичность распознавания и точность разрезания будут намного выше.

Помимо поиска новых CRISPR-систем и Cas9-нуклеаз в различных бактериальных штаммах, люди, овладевшие навыками генной инженерии, сами пытаются тем или иным способом изменить, усовершенствовать эти ферменты под собственные нужды. И это на самом деле возможно, потому что если мы имеем какой-то фермент — скажем, нуклеазу, — то знаем, конечно, его структуру и можем постараться внести туда те или иные модификации, чтобы получить фермент с другими свойствами.

Например, первоначально Cas9-нуклеазы обладали такой активностью, что происходило разрезание обеих цепей ДНК. Это очень ценное качество, но исследователи решили попробовать сделать по-другому, и были получены модифицированные варианты этих ферментов, которые могли разрезать только одну нить ДНК. Почему это хорошо? Опять-таки, для повышения точности! Если мы в одной цепи ДНК делаем разрыв в одном месте, а в другой цепи — со сдвигом, скажем, на десять нуклеотидов в сторону, то направленность и точность распознавания сильно повышается, и единственный на весь геном разрез будет именно в этом месте. Бывают случаи, когда это совершенно необходимо.

Возможны и другие модификации. В частности, варьируя нуклеазную активность фермента, мы можем даже просто ее «убить», чтобы этот фермент совсем не имел нуклеазной активности. Тогда в клетке будет происходить высокоспецифичное распознавание, но никакого разрезания ДНК не произойдет вообще.

Конечно, надо честно признаться, что не все в обсуждаемом нами методе так идеально. Хотя исследователи исходят из того, что направляющая РНК осуществляет строго направленное воздействие и способна распознавать конкретные буквы генетического текста, всегда остается опасение, что случайным образом молекула ДНК может быть где-то разрезана еще и будет нарушена целостность генома. Это явление называется off-target, или внемишенный эффект. Поэтому для биомедицинских целей все усилия исследователей в использовании данного метода направлены на то, чтобы максимально повысить специфичность распознавания.