Чтение онлайн

Рис. 28. Метод ПЦР весьма чувствительный, его проведение требует большой предосторожности. Необходимые пояснения см. на рисунке и в тексте.

Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры около 100о С. При этом комплементарные нити ДНК расходятся между собой (ученые говорят — ДНК денатурирует). Затем к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяют искусственно синтезированные праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые «стартовые» участки. Далее в действие вступает специфический бактериальный фермент — Taq-полимераза. Кроме способности синтезировать ДНК эта полимераза обладает еще одной важной особенностью: она устойчива к высоким температурам, при которых другие белки теряют свои свойства. Термоустойчивая полимераза осуществляет in vitro (т. е. в пробирке) синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей. После нового прогрева до 100о С уже вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция ПЦР. В результате такого «тиражирования» в пробирке уникальных участков генов вируса или бактерий за два-три часа количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Такое количество ДНК уже достаточно, чтобы визуально ее регистрировать с помощью простых приемов, которые уже давно используются молекулярными биологами.

С момента возникновения метод ПЦР постоянно совершенствовался, и в настоящее время он позволяет выявлять в биологических объектах даже единичные вирусные частицы или бактерии. Чувствительность амплификационных тест-систем составляет от 1 до 100 вирусов, в то время как чувствительность иммунологических (не говоря уж о микроскопических) тестов на два-четыре порядка ниже. Кроме того, ПЦР имеет высокую специфичность, которая обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида возбудителя, фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми жесткими условиями их присоединения к матрице при проведении реакции. Соответственно, амплификационные тест-системы, в отличие от иммунологических тест-систем, позволяют избежать проблем, связанных с перекрестно реагирующими антигенами. И наконец, привлекательна быстрота получения результата при использовании ПЦР. За счет автоматизации определение возбудителя осуществляется обычно в течение одного рабочего дня. Правда, очень высокая чувствительность метода имеет и обратную сторону медали: реакция может происходить и при наличии незначительных примесей, случайно попавших в рабочие растворы, на инструменты и даже на хорошо вымытую посуду. От исследователей требуется сверхтщательное отношение к постановке эксперимента, особая культура в технологии проведения подобного рода анализа. Даже наличие одной молекулы вируса, случайно внесенной в реакцию извне (порой даже из воздуха), может дать положительный сигнал, хотя на самом деле в анализируемой крови вирус отсутствует (такой сигнал, как уже говорилось, называется ложноположительным).

ПЦР — метод, позволяющий оценивать наличие в крови как самого вируса, так и провируса (РНК или ДНК). Известная фирма «Ля Рош» активно разрабатывает и продвигает диагностические тест-системы, основанные на технологии ПЦР. Уже в 1994 г. эта компания выпустила первую коммерческую тест-систему под названием «AMPLICOR HIV-1 Monitor», с помощью которой можно было довольно точно и надежно измерить количество РНК ВИЧ-1 («вирусную нагрузку») в крови. Эта система и сегодня является единственной разрешенной Управлением по контролю качества продуктов и лекарств США (FDA) для измерения вирусной нагрузки. Чувствительность теста очень высока, когда речь идет о количестве определяемого материала. Он позволяет выявить наличие всего 50 копий вирусной РНК в 1 мл крови, что значительно чувствительней, чем у других диагностических тест-систем.

Диагностическая чувствительность оценивается в процентах и определяет долю пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора. Например, для французских наборов «Ампликор» диагностическая чувствительность составляет от 95 до 100 %. Российские фирмы-производители выпускают диагностикумы, сходные по этому показателю.

На сегодняшний день ПЦР-наборы для диагностики ВИЧ-инфекции не достигают диагностической чувствительности более 98 %, т. е. выявляют ВИЧ в среднем лишь у 98 из 100 ВИЧ-инфицированных людей, в то время как современные тест-системы, основанные на ИФА, имеют порой чувствительность, равную 99 % и даже более. Разница вроде бы и небольшая, но за ней стоят многочисленные человеческие судьбы. Каждая доля процента — это тысячи людей, у которых или вовремя не обнаружили ВИЧ, и это помешало начать экстренную медицинскую помощь, или наоборот — смертельно напуганных без всякой на то причины. Основная причина меньшей диагностической чувствительности ПЦР при высокой чувствительности самого метода — сильная вариабельность генома ВИЧ, на который она направлена.

Все приведенные оговорки никак не снижают важность метода ПЦР. Особую ценность для диагностики ВИЧ-инфекции ПЦР имеет на двух этапах: в самом начале, когда инфицирование уже произошло, а антитела еще не успели образоваться, и на поздних стадиях заболевания, когда количество антител может снижаться вплоть до полного исчезновения. Количественное определение РНК ВИЧ позволяет устанавливать уровень виремии («вирусную нагрузку»). С помощью ПЦР врачам очень удобно оперативно оценивать, как отражается на пациенте тот или иной вариант противовирусной терапии, который был применен в ходе его лечения.

Приведенные выше данные говорят об отсутствии единого «теста на СПИД». Это определяет в некоторых случаях необходимость использования и иных подходов. После обнаружения ВИЧ врачи обычно используют другие дополнительные тесты, в частности такие, как тест на пневмоцистную пневмонию (разновидность воспаления легких) и онкологию. Имеющий огромный опыт работы по диагностированию ВИЧ у населения академик B. B. Покровский пишет, что «диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам». Он отмечает также типичную ошибку, которая встречается при диагностике ВИЧ-инфекции: часто диагноз устанавливается на основании какого-нибудь одного лабораторного теста, к которому у врача по той или иной причине имеется чересчур сильное доверие. Иногда отдельные сотрудники лабораторий даже сами берут на себя смелость устанавливать диагноз ВИЧ-инфекции, никогда не видя самого больного, а только проанализировав присланную им кровь. А некоторые клиницисты безоговорочно доверяют результатам лабораторных исследований, которые могут служить только как отдельные свидетели в деле вынесения «окончательного приговора». Таким образом, постановка диагноза — дело очень тонкое и ответственное.

Ряд клинических состояний позволяет врачам диагностировать СПИД без лабораторного подтверждения ВИЧ-инфекции, если оно не проводилось или дало неопределенные результаты. B целях клинической диагностики ВОЗ предложила проводить балловую оценку симптомов, имеющихся у подозреваемого на ВИЧ-инфекцию больного. Все эти заболевания считаются косвенными признаками СПИДа:

Персистирующая генерализованная лимфаденопатия (увеличение лимфоузлов — не менее 1 см в диаметре — в двух или более несоприкасающихся внепаховых локусах) — О

Изменения на коже и слизистых оболочках — 1

Снижение массы тела — 1

Выраженная утомляемость — 1

Простой герпес — 2

Диарея продолжительностью свыше 1 мес. — 4 Лихорадка продолжительностью свыше 1 мес. — 4 Снижение массы тела свыше 10 % — 4 Туберкулез легких — 5

Рецидивирующая бактериальная инфекция — 5

Лейкоплакия полости рта (повышенное ороговение эпителия слизистой оболочки) — 5

Стоматит, молочница рта — 5

Локализованная саркома Капоши — 8

Кахексия (крайняя степень исхудания) — 12

При сумме баллов от 0 до 3 вероятность ВИЧ-инфекции очень мала, 4—11 баллов — заболевание вероятно, а 12 и выше — очень вероятно.

Ut supra (как сказано выше), бактерии и вирусы — возбудители инфекционных заболеваний — крайне стойкие организмы. Они очень хорошо выдерживают всевозможные неблагоприятные условия — сухость и влажность, жару и холод, высокое и низкое давление. Поэтому для уничтожения возбудителей обычно применяются очень жесткие меры — химическая или термическая стерилизация. Когда вирус или бактерия находится на хирургических инструментах, на больничных стенах, в сырой пище — такие меры оправданны. Но если возбудитель живет в человеческом организме, автоклав или хлорка скорее убьют более нежного хозяина, чем микроба. Если в отношении бактерий порой достаточно эффективны различные антибиотики, то вирусы на них никак не реагируют. Здесь требуются принципиально иные подходы. Все сказанное имеет отношение и к ВИЧ.

В первые годы после обнаружения такого заболевания, как СПИД, сложилась очень тяжелая ситуация. Была совершенно неясна причина, его вызывающая, поэтому было непонятно, как лечить. Врачи были в полной растерянности. При появлении первых препаратов первоначальное воодушевление быстро сменялось осторожным оптимизмом, а заканчивалось равнодушными проводами очередного «лекарства» на свалку. В качестве ярких примеров, относящихся к тому времени, можно привести препарат Q (из корня китайского огурца) и некий пептид Т, которые вначале были фаворитами у формирующегося сообщества пациентов и активистов, ищущих действенное лечение. Оба этих вещества стали предметом планомерных (и, следовательно, длительных) медицинских испытаний, так что пациенты стали обвинять медико-индустриальный комплекс в бесчувствии и нежелании работать вместе. B ходе серьезных исследований была показана полная бесполезность обоих препаратов.

Растущее чувство усталости и отчаяния открыло широкую дорогу шарлатанам. Типичным лжелекарством был препарат ММ-1, который пропагандировался египетским хирургом-проктологом как «приносящий невероятные исцеления», но доказательства этих утверждений никогда не были представлены. Зато плата была известна — 75 тыс. долларов, и она включала стоимость авиабилета до Заира — именно там проводилось «лечение».

Можно лишь сожалеть по поводу множества продолжающих появляться и в настоящее время безосновательных сообщений о создании чудо-лекарств, якобы способных излечивать от СПИДа. Вспомним недавно разрекламированный арменикум. Или, скажем, корень валерианы, который вроде бы убивает СПИД. Когда сегодня в какой-нибудь газете или телепередаче вы встретите сообщение типа «Найдено лекарство от СПИДа!», отнеситесь прежде всего к нему с сомнением. Медицинская практика приучила относиться к подобным «сенсациям» скептически. Многолетний опыт показывает, что в 99,99 % это не соответствует действительности. Сегодня, когда на сцену выходит очередное «чудо-лекарство», каждый раз вспоминается один из героев О. Генри с его «Настойкой для воскрешения больных», состоявшей, как известно, из воды, хинина и анилиновой краски.