Чтение онлайн

Имея на руках число клеток, я воспользовалась тем преимуществом, что существуют антитела, которые специфически связываются с белком, который экспрессируется исключительно в клеточных ядрах нейронов и только в них. Этот белок называют нейрональным ядерным белком (neuronal nuclear protein – NeuN). Он был открыт в 1992 году [53] , когда его функция была еще неизвестна [54] . У NeuN есть одно важное свойство, которое позволило мне надежно считать экспрессию NeuN маркером всех нейронов, и только нейронов, – присутствие NeuN можно выявить связыванием его специфическими антителами, окрашенными красным красителем и добавленными в суспензию. Это потребовало реакции небольшого количества суспензии с меченными красным красителем анти-NeuN-антителами, и спустя несколько часов я уже могла снова поместить ядра под микроскоп для того, чтобы определить, какой процент всех ядер (окрашенных ранее в синий цвет) принадлежал нейронам (которые теперь были окрашены в красный цвет). Подсчета 500 ядер (что заняло ровно пятнадцать минут) хватило для определения процента нейронов с точностью до 0,2 %. Приложив это процентное отношение нейронов к общему числу клеток в выбранных структурах, я получила общее число нейронов в них. Вычтя это число из общего количества клеток, я получила число всех остальных клеток в ткани (вероятно, это было число глиальных клеток). Сложив результаты, полученные для каждой структуры – а я начала с простого разделения целого мозга на мозговую кору, мозжечок и все остальное, – я впервые в истории получила прямую оценку общего числа нейронов и других клеток в целом мозге крысы. Вся процедура была выполнена меньше чем за один рабочий день.

Я была страшно взволнована. Я теперь знала то, чего в этот момент не знал ни один человек в мире: сколько клеток содержится в целом мозге крысы.

Возник, правда, еще один вопрос: насколько достоверны эти данные, а достоверность в нейроанатомии означает сравнение полученных данных с данными, полученными стереологическим методом. Сравнение было невозможно для тех областей мозга, которые недоступны стереологическому исследованию; в конце концов главной целью создания нового метода и была возможность исследовать те области, где была неприменима стереология. К счастью для нас, в литературе нашлось несколько работ со стереологическими оценками количества нейронов в коре и мозжечке крысиного мозга. Наши результаты были сопоставимы с данными этих работ.

В 2004 году Карл Херруп, работавший в то время в Кливлендском университете, приехал на организованный Роберто и мною в Кашамбу (Бразилия) симпозиум, посвященный важности проблемы определения числа клеток в головном мозге. Карл давно интересовался подсчетом клеток в мозжечке – это его любимый отдел мозга, – но оставил эту идею в связи с отсутствием адекватного метода (мозжечок является плохим объектом стереологического метода из-за высокой плотности расположения крошечных нейронов в зернистом слое, которые расположены настолько тесно, что сливаются при рассматривании их под микроскопом). Карл был научным руководителем одной моей близкой подруги, и благодаря этому я когда-то смогла получить место в его лаборатории и всегда считала его моим неофициальным наставником. Когда в Кашамбу я объяснила Карлу суть моего метода подсчета мозговых клеток, он улыбнулся: «Я думал о чем-то подобном несколько лет назад. Я хотел использовать цитометрию в потоке для подсчета клеток, выделенных из ткани. Но серьезно этой проблемой я так и не занялся. Вы меня опередили, и я рад, что у вас это получилось!» Узнав, что статья о работе уже готова, но не опубликована, Карл сразу же вызвался стать ее редактором в Journal of Neuroscience. А в 2005 году после тщательного обсуждения статьи коллегами Роберто и я получили оттиск статьи, напечатанной в одном из самых авторитетных журналов в этой области биологии [55] .

Несмотря на то что превращение мозга в суп для подсчета общего числа клеток в мозге давало результаты, сравнимые с таковыми, полученными стереологическим методом (там, где такие результаты были), а полученные данные становились все более и более убедительными по мере того, как мы анализировали мозг других биологических видов, наш метод столкнулся с довольно сильным сопротивлением со стороны некоторых специалистов, особенно тех, кто видел, как их любимые теории рушатся перед лицом данных об ином количестве клеток в мозге. Рецензенты и критики хотели видеть одно и то же доказательство – параллельное сравнение нового метода с проверенным стереологическим методом. Я не имела опыта в стереологии, поэтому самостоятельно не смогла бы осуществить такое сравнение еще в течение многих лет. Однако в конце концов, что было к лучшему, не я доказала нашу правоту. Это было сделано независимо от нас в 2014 году Кристофером фон Бартхельдом из университета Рено, а также Дэниелом Миллером и моим будущим сотрудником Джоном Каасом из университета Вандербильта в Нэшвилле [56] . С тех пор как мы с Джоном начали сотрудничать в 2006 году, в его лаборатории была разработана автоматизированная модификация нашего метода подсчета клеток с применением флоуцитометра [57] . Джон и Крис показали, что, по меньшей мере, наш новый метод превращения головного мозга в суп не только так же точен, как стереологический, но он требует меньше времени, более надежен и прост в выполнении [58] . Кроме того, как и было задумано, наш метод позволял получать надежные результаты для сложных гетерогенных структур, как, например, головной мозг, которые невозможно анализировать стереологическими методами [59] .

Новый метод между тем не был назван «методом мозгового супа». Нам было сказано, что этот метод похож на жидкостную версию оптического фракционирования – стереологического метода, в ходе выполнения которого ткани рассекают на срезы, срезы на блоки, а блоки помещают в оптические пробы, и только после этого начинается подсчет клеток. Мы с Роберто тоже поняли, что наш метод должен быть назван «фракционированием». Поскольку мы пошли дальше подсчета клеток в кубиках ткани и расщепили кубики на самые мелкие составные части – ядра, я предложила название «окончательное фракционирование», но Роберто мудро отклонил его. Дело в том, что мы превратили гетерогенную ткань в гомогенную, то есть «изотропную», суспензию ядер, и он предложил другое название – «изотропное фракционирование». Это название осталось за неимением лучшей альтернативы. Не кто иной, как Карл Херруп, заметил мне, что название получилось очень неуклюжим, и я с ним согласилась. Там, где это возможно (а это случается нечасто, так как редакторы научных журналов не любят нарушений формальностей), я предпочитаю называть метод тем, чем он является на самом деле, – методом «мозгового супа».

Теперь, когда в моем распоряжении был метод подсчета мозговых клеток, мне были нужны мозги – и не только человеческие. Мне нужны были мозги широкого спектра других видов для того, чтобы сравнить их с человеческим мозгом: как еще могли мы обнаружить, что наш мозг содержит больше нейронов, чем мозг животных объемом больше нашего, например мозг слона? Мне также хотелось понять эволюционное происхождение разнообразия мозга у разных видов: одинаково ли отношение между размером мозга и числом нейронов у всех млекопитающих, с одинаковой ли скоростью увеличивается число нейронов в разных мозговых структурах, существуют ли универсальные фундаментальные законы, определяющие, из чего состоит мозг. Для достижения этой цели требовались образцы мозга возможно большего числа видов – маленькие и очень маленькие, большие и очень большие – многих групп млекопитающих, помимо общепринятых лабораторных животных: мышей, крыс и, реже, обезьян.

Конечно, надо было с чего-то начать и было очень удобно, что в виварии Института биомедицинских исследований в Рио были не только крысы и мыши, но также хомячки и морские свинки – четыре вида грызунов с восьмикратным разбросом массы тела и девятикратным разбросом массы мозга. Это был хороший старт: я знала, что в нескольких масштабных сравнительных исследованиях клеточного состава мозга, в частности в работе Дональда Тауэра и Герберта Хауга, все млекопитающие сравнивались так, словно они принадлежали одному виду, а мне хотелось избежать этой ошибки (Гейнц Штефан и его команда в Германии все же позаботились о том, чтобы отделить приматов от насекомоядных и летучих мышей в своих исследованиях, но и они привели лишь волюметрические данные, пренебрегая данными денситометрическими, которые могли бы дать хотя бы приблизительное представление о числе нейронов). Так как нам были доступны четыре вида грызунов, я решила, что для начала займусь только ими. Но нам было нужно нечто большее, в частности, нам был необходим мозг очень крупных грызунов, если мы хотели выявить количественные отношения, характерные для построения мозга животных этого отряда.

Здесь нам очень повезло: самый крупный грызун обитает в Южной Америке – это капибара (Hydrochoerus hydrochoerus, «водосвинка», рис. 3.1), бесхвостый бурый мохнатый клубок размером с немецкую овчарку, с квадратной мордой, совершенно не похожий на крыс и других грызунов, если не считать огромных, характерного вида резцов. Это общительное стадное животное обитает на мелководье пресных озер и рек в бассейне Амазонки. При приближении змей или крупных кошачьих – своих врагов – капибара прячется под воду, выставив на поверхность одни только ноздри. К счастью, капибара не является угрожаемым видом. Мясо капибары идет в пищу и считается даже лакомством, особенно на северо-западе Бразилии. Недавно капибар видели в лагунах Рио-де-Жанейро, и они стали настоящей чумой для Кампинаса (штат Сан-Паулу). Говорят, что для того, чтобы получить официальное разрешение на отлов или на охоту на капибар, надо пройти круги бюрократического ада. Кроме того, капибары полюбились публике, которая страшно радуется, завидев их в воде, и мне не хотелось омрачать эту радость. Изучать разнообразие мозга я собиралась не всю жизнь, и мне были не нужны негативные упоминания в прессе о моей скромной особе.

Рис. 3.1. Капибара (Hydrochoerus hydrochoerus) – самый крупный в мире грызун (слева) и агути (Dasyprocta primnolopha) – четвертый по величине грызун (справа)

Как раз в то время, когда я начала искать фермы, на которых разводили капибар для ресторанов Северо-Запада, Роберто Лент, мой сотрудник, получил новость от Кристовау Пикансо-Диниза, своего коллеги из Федерального университета в Белем-ду-Пара, в Северной Бразилии. Бразильское ведомство по возобновлению природных ресурсов и защите окружающей среды захватило двух капибар, которых нелегально выращивала на мясо одна семья, и уже хотело как-то от них избавиться, когда сотрудникам ведомства пришло в голову поинтересоваться у Кристовау, который изучал сенсорные представительства в головном мозге, не нужны ли ему капибары (нет, я не знаю, каким был ход мыслей сотрудников). Кристовау знал о новом направлении наших исследований по сравнительной анатомии мозга и предложил нам мозг этих капибар. Его студенты, напялив выданные им мясницкие фартуки, забили животных, и нам прислали их головы в большом пластиковом контейнере, залитые раствором параформальдегида. Это было страшное и зловонное послание, но мы радовались как дети: у нас теперь был мозг капибары!

Любезность Кристовау этим не исчерпалась. Он снабдил нас еще двумя экземплярами мозга другого крупного амазонского грызуна – агути (Dasyprocta primnolopha; рис. 3.1). Это довольно злобное животное размером с домашнюю кошку, которое во время еды сидит на задних лапах и держит еду двумя передними лапами, как крыса. Это четвертый в мире по величине грызун, который уступает североамериканскому бобру и южноамериканской паке, но при массе тела 3–4 кг он нам идеально подходил. Теперь у нас была партия из шести грызунов разных видов с массой тела от 40 г (лабораторная мышь, Mus musculus) до более чем 40 кг (капибара) и с массой мозга от 0,4 до 75 г (что можно сравнить с массой головного мозга макака). Теперь оставалось превратить все эти мозги в суп.

Как новичок в этой области, я не могла представить себе тогда всю реальную важность числа нейронов и других клеток, которое мы теперь могли определить у разных видов грызунов. Я чувствовала, что теперь, имея возможность исследовать клеточный состав мозга разных видов, мы находимся на пороге чего-то важного, но мне хотелось послушать мнение и других специалистов. Так как в то время мы еще не успели опубликовать описание нашего метода «изотропного фракционирования» и данные исследования мозга шести грызунов, мне надо было поговорить с кем-то лично и объяснить, что мы делаем.