Чтение онлайн

В 1917 году, спустя два года после публикации статьи Туорта, вирусы бактерий заново открыл канадский врач Феликс д’Эрелль. Во время Первой мировой войны д’Эрелль служил во Франции, и ему поручили расследовать причину вспышки дизентерии, которая косила солдат одного из кавалерийских эскадронов. Стремясь выяснить, почему одни больные выздоравливают, а другие нет, д’Эрелль взял у пациентов образцы кала и подверг их обстоятельному, хотя и достаточно грубому анализу. Сначала он пропустил кровянистый стул своих подопечных через мелкоячеистый фильтр, чтобы удалить из него все твердые частицы – включая бактерии. Затем д’Эрелль налил немного отфильтрованной жидкости на культуры бактерий рода Shigella, вызывающих дизентерию. На следующий день он с удивлением обнаружил, что одна из культур заразных бактерий под фекальной жидкостью “растворилась подобно сахару в воде” – исчезла буквально за ночь [50] . Что еще интереснее, когда д’Эрелль поспешил в госпиталь узнать о состоянии пациента, у которого был взят этот образец кала, он обнаружил, что больному заметно лучше. Сопоставив эти факты, д’Эрелль заключил, что возбудителя дизентерии уничтожил некий паразит, которого ученый назвал бактериофагом (“пожирателем бактерий”); эта форма жизни должна была быть достаточно маленького размера, чтобы пройти через фильтр. Судя по всему, “бактериофаг” заражал бактерии фактически так же, как другие вирусы инфицировали растения или животных.

В последующие годы было открыто множество бактериофагов, или, сокращенно, фагов, и выяснилось, что каждый из них поражает свой конкретный вид бактерий. По мере накопления знаний о новых разновидностях фагов увеличивался ажиотаж вокруг так называемой фаговой терапии – идеи о том, что бактериофагов можно использовать для лечения микробных инфекций. Хотя некоторым ученым претила идея вводить живые вирусы в организм человека, клинические испытания показывали, что фаги “не замечают” человеческие клетки и видимых побочных эффектов у фаговой терапии нет. В 1923 году д’Эрелль помогал советским ученым организовать институт в Тбилиси [51] , исследования в котором были посвящены бактериофагам; во времена своего расцвета учреждение насчитывало более тысячи сотрудников, производящих тонны фагов в год для клинического использования [52] . В некоторых уголках мира фаговую терапию используют и по сей день – в Грузии в настоящее время фаги назначают при бактериальных инфекциях примерно в 20 процентах случаев [53] . Однако после того как в 1930-х были открыты антибиотики (а в 1940-х началось их массовое производство), этот способ терапии был быстро забыт, особенно на Западе.

Хотя бактериофаги нашли лишь ограниченное применение в медицине, для генетиков они стали настоящим подарком судьбы. К тому моменту, когда ученые с помощью новых электронных микроскопов с большим увеличением смогли впервые увидеть фагов (это случилось в 1940–1950-е годы), эти вирусы вкупе с бактериями-жертвами уже предоставили очередное доказательство дарвиновской теории естественного отбора. Они помогли установить, что именно ДНК, а не белки, служит “молекулой наследственности” в клетках. Тот факт, что генетический код триплетен (то есть каждые три “буквы” ДНК обозначают одну аминокислоту в белке), был впервые продемонстрирован на примере фагов; эксперименты с последними позволили также выяснить, как “включаются” и “выключаются” гены внутри клетки. Даже открытие Джошуа Ледерберга (он обнаружил, что вирусы могут вносить чужеродные гены в инфицированные ими клетки, и это стало одним из ранних подступов к генной терапии) было сделано благодаря фагу, специализирующемуся на бактериях рода Salmonella. Во многом именно эксперименты с вирусами бактерий заложили основы молекулярной генетики.

Кроме того, изучение фагов послужило толчком к революции в молекулярной биологии 1970-х годов. Исследуя иммунные механизмы, с помощью которых бактерии дают отпор фаговым инфекциям, ученые обнаружили класс ферментов, называемых эндонуклеазами рестрикции; их можно “настроить” таким образом, чтобы они разрезали фрагменты искусственно синтезированной ДНК (это было показано в простых экспериментах вне живых объектов). Используя сочетание этих ферментов с другими ферментами, выделенными из инфицированных фагами клеток, исследователи сумели создать и клонировать искусственные молекулы ДНК в лабораторных условиях. Одновременно с этим геномы фагов послужили прекрасной мишенью для только что разработанных технологий секвенирования ДНК. В 1977 году Фред Сенгер и его коллеги успешно определили последовательность всех нуклеотидов ДНК в геноме фага ФX174. Двадцать пять лет спустя тот же фаг снова оказался в центре внимания: он стал первым объектом, чей геном был синтезирован с нуля [54] .

Впрочем, бактериофаги – это не просто популярные “подопытные кролики”. Это еще и наиболее многочисленные биологические объекты на планете – и по этому показателю они лидируют с большим отрывом. Фаги в природе так же вездесущи, как свет и почва, и их можно найти в грязи, воде, человеческом кишечнике, горячих источниках, ледяных кернах и практически во всех других местах, где возможна жизнь. Ученые оценивают численность бактериофагов на Земле в 1031 вирусных частиц – десять миллионов триллионов триллионов, или единица с 31 нулем. В одной чайной ложке морской воды в пять раз больше фагов, чем в Нью-Йорке людей. Невероятно, но фагов на планете намного больше, чем бактерий, которые они могут инфицировать; столь же вездесущие, как и микроорганизмы, бактериофаги превышают численность последних на порядок. Они вызывают примерно триллион триллионов инфекций по всему миру каждую секунду, а если брать только океан, то там ежедневно от смертоносного заражения фагами погибает около 40 % всех бактерий [55] .

Эти вирусы созданы для убийства: в течение миллиардов лет они эволюционировали, чтобы научиться заражать бактерии с беспощадной эффективностью. Все фаги состоят из прочной белковой наружной оболочки, называемой капсидом, в которую упакован генетический материал. Фаговый капсид может иметь одну из десятков разнообразных форм, и все они спроектированы таким образом, чтобы максимально эффективно защищать геном вируса и успешно переносить его генетический материал в бактериальные клетки, где тот способен размножаться и распространяться. Некоторые фаги имеют изящную икосаэдрическую форму, у других длинный хвост присоединяется к шарообразному капсиду. Нитевидные фаги цилиндрические. Возможно, самые устрашающие из этих вирусов – те, что похожи на инопланетные корабли, с “ногами” для закрепления на поверхности клетки, “головой”, в которой хранится ДНК [56] , и “насосами”, впрыскивающими эту ДНК в клетку после того, как фаг закрепится снаружи.

Примеры различных бактериофагов

Методы работы вирусов, как и их внешний вид, разнообразны, но неизменно (и смертоносно) эффективны. Некоторые вирусные геномы упакованы в капсид так плотно, что генетический материал под давлением буквально выстреливает в клетку, словно пробка от шампанского, как только нарушается целостность белковой клеточной оболочки. Сразу после того, как геном вируса попал в клетку, он способен захватить контроль над клеткой-хозяином одним из двух способов. При паразитическом, или лизогенном, жизненном цикле геном вируса внедряется в геном хозяина и в таком виде, никак себя не проявляя, может передаваться из поколения в поколение, ожидая подходящего момента для нападения. Напротив, при инфекционном, или литическом, жизненном цикле геном вируса сразу же захватывает ресурсы клетки-хозяина, заставляя их работать на себя: производить вирусные белки вместо микробных и многократно копировать геном фага до тех пор, пока клетка не лопнет от распирающих ее вирусных частиц, разбросав последние на соседние бактерии. С помощью этого цикла внедрения в клетку, захвата контроля над ней и распространения по ее потомкам или соседям один-единственный фаг может полностью уничтожить целую популяцию бактерий за считанные часы.

Но бактерии не так уж беспомощны в этой старой как мир войне. Точно так же как растения и животные, за миллиарды лет эволюции они выработали впечатляющие стратегии защиты. К моменту нашего разговора с Джилл у бактерий уже были открыты четыре основные защитные системы [57] . В рамках наиболее выдающейся из них бактерии “навешивают” на свой геном уникальные метки, немного меняющие химические свойства ДНК, но не меняющие экспрессию генетической информации. В дополнение к этому бактерии производят ферменты (эндонуклеазы рестрикции), которые разрезают любую ДНК, не несущую таких меток, зачищая клетку ото всех фаговых генов, проникших под ее оболочку. Также бактерии способны попросту заблокировать фаговой ДНК путь внутрь себя – либо заделывая отверстия, проделанные этими вирусами, в результате чего последние не могут ввести ДНК в клетку, либо делая неузнаваемыми белки на своей поверхности, к которым в обычных условиях прикрепляются фаги. У бактерий даже развилась способность чувствовать наступающую инфекцию и “совершать самоубийство” до распространения заразы – самоотверженный способ защитить остальные клетки в сообществе.

Литический жизненный цикл бактериофага

Может ли CRISPR быть еще одним механизмом антивирусной защиты? Чем больше я читала о гонке вооружений между бактериями и бактериофагами, тем более вероятным мне казалось существование других, еще не открытых, орудий, которые они используют в борьбе друг с другом.

Более того, узнавая все больше о CRISPR, я начинала понимать, в каком направлении будут двигаться исследования в нашей лаборатории, если мы примем предложение Джилл. Расчеты голландца Рююда Янсена и его коллег [58] – это они в 2002-м предложили аббревиатуру CRISPR – выявили набор генов, которые в бактериальных хромосомах почти всегда примыкали к участкам с CRISPR. Они разительно отличались и от повторяющихся последовательностей, и от спейсеров в CRISPR.

Даже то немногое, что мы тогда знали об этих ассоциированных с CRISPR генах, или cas– генах, подсказывало, что они представляют собой нечто крайне интересное. Сравнение их строения со строением уже известных генов позволило предположить, что cas– гены кодируют специализированные ферменты, в чьи функции может входить разделение двух цепочек двойной спирали ДНК или разрезание молекул РНК либо ДНК, как у эндонуклеаз рестрикции (последние режут только ДНК).

Учитывая, насколько полезным оказалось открытие эндонуклеаз рестрикции для развития технологии рекомбинантных ДНК в 1970-е годы, казалось весьма вероятным, что при более глубоком изучении разных аспектов работы CRISPR мы обнаружим целый клондайк новых ферментов – и эти белки тоже будут иметь значительный биотехнологический потенциал.

Вот так все это и случилось. Я оказалась на крючке.

Учеными, которые занимаются фундаментальными исследованиями, движут азарт, любопытство, интуиция и упорство – но вдобавок к этим возвышенным качествам нам необходима здоровая доза практичности. Это и банальные поиски финансирования, и непрерывное решение вопросов управления. Те из нас, кто руководит собственными лабораториями, вынуждены делегировать другим ученым множество задач, которые мы прекрасно умеем выполнять самостоятельно. Часто это означает, что каждый раз, когда мы приступаем к новому для нас направлению исследований, нам нужно найти подходящего человека, который отвечал бы за этот участок.