Биологические основы старения и долголетия
Шрифт:
Таким образом, накопление повреждений в геноме стареющих клеток происходит не только вследствие нарушения равновесия между процессами возникновения спонтанных повреждений ДНК и их репарации, но и потому, что уменьшается репарируемость повреждений.
Для того чтобы повреждение могло быть репарировано, оно должно быть доступно для действия репарирующих ферментов. Но ДНК в хроматине ядра находится в упакованном состоянии. Возникающие в некоторых участках генома повреждения ДНК с трудом могут быть "найдены" ферментами репарации. Это особенно относится к тем участкам генома, которые обычно неактивны, синтез РНК на которых не происходит. Если облучить клетку ультрафиолетовым излучением и определить скорость репарации повреждений ДНК, индуцированных этим излучением, то оказывается, что именно в таких участках повреждения ДНК остаются длительное время невосстановленными. Казалось бы, поскольку эти гены функционально неактивны, то и накопление в них повреждений безразлично для клетки. Однако так обстоит дело только до определенной поры. Если клетка вступает в фазу деления, то на таких "испорченных" матрицах будет синтезироваться ДНК с неправильной последовательностью оснований или ДНК, вовсе не содержащая оснований в участке, комплементарном "испорченной матрице". Если в результате повреждений ДНК произойдет нарушение синтеза и распределения между дочерними клетками той пары хромосом, в состав которой такая ДНК входит, клетки могут погибнуть.
Повреждения, возникающие в функционально инертных генах, должны "проявиться" также в тех случаях, когда возникает потребность в их активации, например при гормональной и субстратной индукции синтеза белка и при синтезе антител в ответ на поступление в организм чужеродных антигенов. Во всех этих случаях синтезируемые на "испорченных" матрицах ДНК могут быть функционально неактивными или направлять синтез мутантных белков. Следовательно, рассмотренный процесс накопления повреждений ДНК в тех генах, которые вследствие относительно прочной связи с белками репрессированы (временно или постоянно) и малодоступны для репарации, очевидно, является важной причиной снижения способности старых клеток к индукции синтеза ферментов и антител. Но ведь ранее мы пришли к заключению, что такого рода возрастные изменения определяют уменьшение функциональной способности различных органов, являются характерным признаком старения всего организма. Значит, теперь мы можем определить уровни старения и связи между ними — от молекул до организма.
Существует еще одно обстоятельство, которое делает весьма опасным длительное сохранение в клетках повреждений ДНК. Участки ДНК, содержащие изменения в структуре, вызванные различными повреждающими воздействиями (будь то тепло, ионизирующее или ультрафиолетовые излучения или химические вещества), обладают повышенным "сродством" не только к ферментам, участвующим в репарации этих повреждений, но и к другим белкам. Причем в последнем случае может образоваться химическая, связь (сшивка) между модифицированным участком ДНК и белком (см. рис. 1). После этого клетке труднее провести репарацию ДНК. Более того, такая сшивка ДНК — белок может быть нерепарируемой вообще, что означает необратимое нарушение или, скорее, выключение функции гена.
Ведь независимо от того, в каком синтезе участвует этот ген — в синтезе ДНК или РНК, для обоих этих процессов необходимо, чтобы ферменты, их катализирующие (соответственно ДНК- и РНК-полимераза), продвигались, "скользили" вдоль матрицы. Когда ферменты достигнут участков ДНК, содержащих сшивки ДНК с белком, весьма вероятно, что их продвижение будет остановлено, и, следовательно, редупликация гена, или его транскрипция, окажется незавершенной. Рассмотренный механизм выключения функции гена мы и называем инволюционной репрессией.
В предыдущем издании этой книги автор мог привести лишь один результат изучения изменений ДНК клеток в процессе их старения. Как же продвинулось исследование этого вопроса за прошедшие 11 лет?
Прежде всего обратим внимание на то, что в результате того или иного воздействия на ДНК в ней могут возникать самые различные повреждения, причем в самых различных количествах. Естественно, это очень затрудняет изучение изменений ДНК при старении. Ведь большинство типов повреждений, очевидно, даже к старческому возрасту накапливается в геноме в очень малых относительных количествах (по сравнению с чувствительностью даже самых совершенных методов анализа структуры ДНК). Поэтому, чтобы определить характер повреждений ДНК, возникающих и накапливаемых в геноме клеток при их старении, необходимо теоретически предвидеть наиболее существенные из этих типов повреждений. Об одном способе такого предвидения мы уже рассказали — он состоит в анализе биофизических свойств ДНК и механизмов ее спонтанной (тепловой) нестабильности.
Другой путь — проанализировать характер повреждений ДНК, индуцируемых ионизирующим излучением или химическими веществами, и попытаться определить общие механизмы возникновения этих повреждений. Если есть теоретические основания полагать, что такие механизмы "работают" и в неповрежденной клетке, то можно ожидать, что и в процессе старения с относительно большой вероятностью можно обнаружить накопление повреждений ДНК сходного типа.
Один из наиболее изученных продуктов, образуемых в ДНК после облучения клеток ионизирующей радиацией или в результате воздействия на нее химическими мутагенами, — это гликоль тимина или тимидина. Такие продукты образуются в результате окислительной деструкции ДНК. Но различные вещества (ОН·,
Максимальная (видовая) продолжительность жизни человека, по мнению многих исследователей, составляет примерно 100 лет. У лабораторных крыс она варьирует в зависимости от линии и достигает 4 лет. Иными словами, человек примерно в 25 раз долговечнее, чем крыса. Таким образом, между интенсивностью выделения гликоля тимина и продолжительностью жизни, возможно, существует обратно пропорциональная зависимость.
Модифицированные нуклеотиды или основания сначала выделяются во внутриклеточное пространство в процессе репарации ДНК с помощью ферментов, вырезающих поврежденные участки ДНК. Лишь затем они или продукты их метаболизма выводятся сначала из клетки, а потом и из организма. Но отсюда следует, что, чем больше выводится этих продуктов с мочой, тем больше их образуется и из ДНК клетки. Стало быть, открывается возможность на основании анализа продуктов метаболизма ДНК в моче делать хотя бы косвенные заключения об интенсивности химической модификации ДНК в клетках и роли таких модификаций в развитии различных болезней (особенно опухолей) и в старении.
Теперь я расскажу подробнее о результатах исследований, проведенных нами на культивируемых клетках человека. Повреждения ДНК клеток человека были исследованы при старении этих клеток в организме (in vivo), а также вне организма (in vitro). Кроме того, такие повреждения ДНК были сопоставлены с повреждениями ДНК, возникающими при не очень интенсивном прогревании клеток или облучении их ионизирующим излучением. Рассказывая о наших данных, я познакомлю любознательного читателя с некоторыми особенностями изучения повреждений ДНК "щадящим" методом.
Один из основных методов анализа ДНК, использованных нами при исследовании этих вопросов, — метод седиментации ДНК в градиенте щелочной сахарозы. Этот метод уже упоминался (см. с. 27). Мы сразу перейдем к рассмотрению полученных вместе с А. Н. Хохловым данных, делая пояснения методики при изложении результатов.
На рис. 8 представлены седиментограммы ДНК эмбриональных фибробластов и фибробластов, полученных из кожи 91-летнего донора. На графике указано, какой процент ДНК от общей массы ДНК (содержавшейся в клетках, нанесенных на градиент) был в той или иной из фракций (частей), на которые разделяли содержимое центрифужной пробирки после окончания центрифугирования. 1-я фракция соответствовала дну пробирки, 15-я — верху градиента. Это означает, что высокомолекулярные фракции ДНК — первые, низкомолекулярные — последние номера фракций. И следовательно, чем больше седиментограмма сдвинута вправо, тем меньше среднее значение молекулярной массы ДНК, тем больше в ней было разрывов.
Рис. 8. Профили седиментации ДНК диплоидных фибробластов медицинского абортуса (1) и фибробластов кожи 91-летней женщины (2). Цифры на рисунке — средние значения молекулярных масс ДНК соответствующих клеток
На графике приведены также значения средневесовых молекулярных масс, рассчитанных с помощью ДНК фага b2. Молекулярная масса этой ДНК известна, а положение ее в градиенте, использованном при исследовании клеток человека, позволяло рассчитать массу их ДНК.
Очевидно, нелишней будет такая подробность. Штаммы эмбриональных фибробластов были получены из Института медицинской генетики АМН СССР. Предварительно они были исследованы там К. Н. Гринбергом, и хромосомных изменений в них не было найдено, т. е. это были нормальные клетки, хотя получены они были из тканей при аборте. Культуры "взрослых" и "старых" фибробластов получены безболезненным и безвредным методом биопсии с передней поверхности кожи предплечья здоровых доноров, пожелавших, чтобы их клетки были обследованы. (Здесь я опять должен с благодарностью вспомнить о большой помощи со стороны К. Н. Гринберга и Г. Д. Бердышева.) Клетки кожи 91-летней женщины к нам попали из Института геронтологии АМН СССР (Киев), где эта пациентка находилась на обследовании (и у нее не было найдено резких патологических изменений).