Чтение онлайн

Стимуляция гонадотропинами (ФСГ) начинается, как правило, через 14 дней после начала даунрегуляции (длинный протокол) либо в течение первых трех дней цикла – короткий протокол (1-й день цикла = 1-й день менструации). Лечение гонадотропина-ми длится в среднем 11–13 дней. В течение этого периода в одно и то же время суток осуществляются внутрикожные (или внутримышечные) инъекции определенного количества гормона. Если для подавления собственных гормонов используется антагонист ГнРГ, его введение начинается с 5-7-го дня стимуляции.

Во время стимуляции проводится ультразвуковое наблюдение. Этот мониторинг служит для контроля за количеством и размерами фолликулов, а также толщиной эндометрия. Таким образом можно выбрать оптимальный момент для начала овуляции и пункции фолликулов. Также благодаря наблюдению удается снизить риск гиперстимуляции.

Овуляция и забор яйцеклетки

Когда созревание яйцеклеток в фолликулах подходит к концу, необходимо отменить введение ФСГ. Теперь с помощью другого гормона – ХГЧ (хорионический гонадотропин человека) – яйцеклетки подготавливаются к овуляции. ХГЧ берет на себя роль ЛГ, которую последний выполняет в естественном цикле. ХГЧ получают из мочи беременных женщин, а в последнее время в чистом виде с помощью биотехнологий. Спустя около 36 ч после введения ХГЧ, незадолго до овуляции, происходит забор яйцеклеток из фолликулов.

Существует несколько методов забора яйцеклеток для оплодотворения. Ооциты могут быть получены при лапароскопии, мини-лапаротомии или путем аспирации фолликулов под контролем УЗИ.

Методика лапароскопии

Премедикация и общая анестезия проводятся так же, как и при обычной лапароскопии. В брюшную полость вводится газовая смесь, содержащая 5 % СО, 5 % О, 90 % N. Аспирацию предовуля-торного фолликула производят длинной иглой (24 см), изогнутой под углом 45° с наружным диаметром 1,3 мм и просветом в 1,1 мм. Игла проводится через канюлю, введенную в брюшную полость в точке, расположенной на середине между лонным сочленением и пупком по средней линии живота.

Для аспирации фолликула применяется пониженное давление. Точка пункции фолликула должна располагаться в неваскуляризо-ванной области или примыкать к стромальным элементам яичника для того, чтобы предотвратить утечку фолликулярной жидкости из переполненного фолликула. Собранная фолликулярная жидкость может быть сразу исследована на содержание в ней яйцеклетки.

Забор яйцеклеток до момента овуляции необходим, так как после овуляции яйцеклетка попадает в маточную трубу или брюшную полость, где становится практически недоступной.

Предовуляторная яйцеклетка человека может быть обнаружена невооруженным глазом по наличию в аспирате массивных и клейких хлопьев размером до 5 мм и более. Однако важно убедиться, что яйцеклетка действительно находится в этих хлопьях путем их просмотра в препарационном микроскопе. Яйцеклетка 2 раза обмывается оплодотворяющей средой, которая удаляет большую часть фолликулярной жидкости. Затем она переносится в капле равновесной оплодотворяющей среды под стерильное парафиновое масло. В качестве оплодотворяющей среды применяется раствор тироде, содержащий пируват, альбумин, антибиотики.

Оплодотворение и перенос эмбрионов

Для оплодотворения яйцеклеток в день пункции необходимо наличие свежей спермы супруга. Сперму получают путем мастурбации. В редких случаях супруг сдает сперму заранее и она хранится в лаборатории при очень низкой температуре (криоконсервация спермы). Сперму с учетом ее разжижения при комнатной температуре разводят в 2 смывах оплодотворяющей среды. Удаление семенной плазмы производят следующим образом. Небольшое количество спермы разводят в 4-кратном объеме оплодотворяющей среды, затем суспензию сперматозоидов центрифугируют, удаляют надсадочную жидкость, ресуспензируют комочек сперматозоидов и повторяют эту процедуру. Полученный таким образом комочек сперматозоидов вновь ресуспензируют, определяют их концентрацию и подвижность и доводят эти параметры до значений, которые считаются стандартными для процедуры оплодотворения яйцеклетки.

Затем сперматозоиды переносят в специальный термостат, где уже находятся яйцеклетки. При осеменении на 1 яйцеклетку добавляют 200 000–300 000 сперматозоидов.

Процесс культивирования происходит в специальной среде с абсолютной влажностью, при температуре 37 °C в растворе с рН, равным приблизительно 7,6, в атмосфере, содержащей 5 % СО2, 5 % О2 и 90 % Яйцеклетку оставляют в суспензии сперматозоидов на 6-18 ч.

Следующие морфологические особенности яйцеклетки, большинство которых выявляют с помощью микроскопа, могут определить признаки произошедшего оплодотворения:

1) выталкивание второго полярного тельца в желточное пространство;

2) цитоплазма яйцеклетки сжимается, отступая от оболочки;

3) в ранней стадии оплодотворения в цитоплазме яйцеклетки может наблюдаться головка, срединный сегмент и хвост сперматозоида. Эти признаки могут отмечаться только при сильном увеличении, используя фазово-контрастную методику;

4) в более поздние стадии (около 12–18 ч после инсеменации) в цитоплазме могут быть мужские и женские проядра.

Деление зиготы

После завершения периода инсеменации яйцеклетку переносят в равновесную каплю среды по парафиновое масло. Среда состоит из свежеприготовленного раствора Ham F10 с добавлением 15 % сыворотки крови больной. Растущий эмбрион человека культивируется при температуре 37 °C в атмосфере, содержащей 5 % СО 2, 5 % О 2и 90 % N 2в среде с рН, равным 7,3.

О нормальном развитии эмбриона в культуре свидетельствует появление делящихся клеток приблизительно одинакового размера и формы, которые равномерно заполняют большую часть пространства в пределах блестящей оболочки. Деление клеток должно быть нарастающим и наблюдаться во время четко определенного времени. Так, эмбрион должен содержать 2 клетки через 35–46 ч, 4 клетки через 51–63 ч, 8 клеток через 68–86 ч после инсемена-ции, а стадия 16 клеток должна быть достигнута в пределах 84– 112 ч после оплодотворения.

Если клетки развивающегося эмбриона имеют неправильную форму или отходят от блестящей оболочки, или же скорость деления клеток существенно отличается от описанной выше, то развитие эмбриона считается патологическим и он непригоден для переноса в полость матки.

Оставшиеся эмбрионы хорошего качества могут быть сохранены при очень низкой температуре для дальнейших попыток (криоконсервация эмбрионов).

Так как в большинстве случаев эмбрион переносится в полость матки на стадии 8 или 16 клеток, то это означает, что эмбрион человека перед имплантацией должен содержаться в культуре в течение 3–4 суток.

Эмбрион в 0,05 мл культуральной среды осторожно засасывается в стерильный катетер диаметром 1,4 мм. Затем катетер проводится через цервикальный канал в полость матки, где в области дна эмбрион высвобождается из катетера. С целью облегчения проведения этой процедуры катетер следует разместить по длине для контроля положения его конца в полости матки. Помимо этого, следует очень аккуратно манипулировать шейкой матки во избежание сокращения мышц матки. Если в полость матки переносят более двух эмбрионов, существенно повышается риск многоплодной беременности. После переноса эмбрионов в полость матки назначают препараты прогестерона и эстрогены, чтобы поддержать имплантацию эмбриона. В этом случае говорят о поддержке лютеино-вой фазы.