Чтение онлайн

При серодиагностике криптококкоза используют реакцию преципитации для определения IgM АТ, которые обнаруживают на 2 - 3-й неделе заболевания у 75% больных, затем постепенно исчезают [42]. Комплементсвязывающие IgG АТ появляются позднее, их титр 1:32 и выше предполагает возможность диссеминированной инфекции.

При легочном гистоплазмозе у 90% больных определяются АТ к H. capsulatum в РСК и методом иммунодиффузии, при диссеминированном процессе они встречаются в 80% наблюдений [51]. Перекрестные реакции наблюдаются при бластомикозах, коккцидиоидомикозе и паракоккцидиоидомикозе.

type: dkli00090

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Основу молекулярно-генетических методов составляет ПЦР и ее модификации. Принцип ПЦР заключается в многократном повторении (амплификации) исследуемых локусов нуклеиновых кислот термостабильной полимеразой для наработки достаточного количества ДНК и обнаружения ее методами электрофореза и гибридизации. Этот процесс достигается с помощью введения в реакционную смесь коротких молекул ДНК (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям того микроорганизма, который необходимо обнаружить. Связывание праймеров с соответствующими участками ДНК/РНК приводит к образованию локальной двухцепочечной структуры узнаваемой полимеразой, которая начинает достраивать ее в направлении 5- 3’, используя дезоксинуклеозидтрифосфаты, присутствующие в реакционной смеси. Таким образом, если один из праймеров связывается с прямой цепью, а другой с обратной, происходит наработка продукта, ограниченного с двух сторон этими праймерами. Поскольку каждый из вновь образованных продуктов - матрица для дальнейшей амплификации, происходит экспоненциальное увеличение их количества.

Анализ полученных продуктов амплификации с помощью электрофореза заключается в разделении ампликонов под действием электрического поля в агарозном или полиакриламидном геле. После окончания электрофореза оценивается наличие и размер полученных продуктов реакции амплификации. Гибридизация заключается в нанесении на твердую фазу (микропланшет) олигонуклеотидных зондов, комплементарных внутренней структуре исследуемых ампликонов (прямая гибридизация), или нанесении на твердую фазу полученных ампликонов (обратная гибридизация).

Добавление ампликонов или зондов, меченных либо с помощью радиоактивных меток, либо флюоресцентных, либо конъюгированных с ферментом, способным осуществлять цветовую реакцию (например, пероксидаза хрена), приводит к образованию комплексов, которые можно определять с помощью соответствующих методов. Достоинство гибридизации по сравнению с гель-электрофорезом - увеличение специфичности метода и объективизация оценки результатов эксперимента в автоматическом режиме. К недостаткам относится трудоемкость, необходимость использования специальной аппаратуры и более высокая стоимость.

Существуют наборы ПЦР для выявления отдельных микроорганизмов ( L. pneumophila, C. pneumoniae, M. pneumoniae, S. pneumoniae, M. tuberculosis, M. a vium, M. kansasii, H. capsulatum, B. dermatidis, C. immitis, A. fumigatus, P. jiroveci, T. gondii, респираторных вирусов, ВПГ, ЦМВ, ТОРС-коронавируса) и одновременного выявления нескольких возбудителей.

Наиболее перспективна - мультиплексная ПЦР в реальном времени, позволяющая определять наличие ДНК различных возбудителей в одной пробирке в течение менее 3 ч. Принцип основан на непосредственном иммунофлюоресцентном определении амплифицированных генов по мере их генерации in vitro. Эффективность подобного подхода была доказана в ряде исследований [52]. Однако требуется осторожность в интерпретации результатов для дифференциации между колонизацией (или латентными формами) и инфекцией. Пневмококки, хламидии, микоплазмы, кандиды, пневмоцисты встречаются у индивидуумов и в отсутствие инфекции. Герпес-вирусы, токсоплазмы, пневмоцисты могут существовать в латентной стадии в тканях и не вызывать инфекцию.

Некоторые организмы трудно или невозможно выявить другими методами и молекулярная диагностика становится единственно возможной. Диагностическая специфичность и чувствительность могут достигать 98 - 100%.

type: dkli00064

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лаборатории клинической микробиологии играют жизненно важную роль в этиологической диагностике ИНДП. Надежность результатов микробиологического исследования зависит от целого ряда условий:

– -- правильного получения адекватного материала;

– -- своевременной его доставки в лабораторию в соответствующих средах или контейнерах;

– -- преданалитической обработки образцов в соответствии с задачами исследования;

– -- чувствительности и специфичности используемых методов для выявления возбудителя и его маркеров;

– -- грамотной трактовки результатов исследования в соответствии с клиническими, радиографическими и другими лабораторными данными пациента.

9

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Ansorg R., van der Boom R., Rath P.M. Detection of Aspergillus galactamannan antigen in foods and antibiotics // Mycoses.
– 1997.
– Vol. 40.
– P. 353 - 357.

2.Boersma W.G., Lowenberg A., Lolloway Y. Pneumococcal capsular antigen detection and pneumococcal serology in patients with community-acquired pneumonia // Thorax.
– 1991.
– Vol. 46.
– P. 902 - 906.

3.Bradsher R.W., Chapman S.W., Pappas P.G. Blastomycosis // Infect. Dis. Clin. N. Am.
– 2003.
– Vol. 17.
– P. 21 - 40.

4.Capeding M.R.Z., Nohynek H., Ruutu P. Evaluation of a new tube latex agglutination test for detection of type-specific pneumococcal antigens in urine // J. Clin. Microbiol.
– 1991.
– Vol. 29.
– P. 1818 - 1821.

5.Cook D.J., Fitzgerald J.M., Guyatt G.H., Walter S. Evaluation of the protected brush catheter and bronchoalveolar lavage in the diagnosis of nosocomial pneumonia // J. Intens. Care Med.
– 1991.
– Vol. 6.
– P. 196 - 205.

6.Crawford S.W., Bowden R.A., Hackman R.C. Rapid detection of cytomegalovirus pulmonary infection by bronchoalveolar lavage and centrifugation culture // Ann. Intern. Med.
– 1988.
– Vol. 108.
– P. 180 - 185.

7.Cregan P., Yamamoto A., Lum A., e.a. Comparison of four methods for rapid detection of Pneumocystis carinii in respiratory specimens // J. Clin. Microbiol.
– 1990.
– Vol. 28.
– P. 2432 - 2436.

8.Duperval R., Hermans P.E., Brever N.S., et.al. Cryptococcosis, with emphasis on the significance of isolation of Cryptococcus neoformans from the respiratory tract // Chest.
– 1977.
– Vol. 72.
– P. 13 - 19.

9.Fishman J.A., Roth R.S., Zanzot E.М. Use of induced sputum specimens for microbiological diagnosis of infections due to organisms other than Pneumocystis carinii // J. Clin. Microbiol.
– 1994.
– Vol. 32.
– P. 131 - 134.

10.Freidig E.E., Smith T.F., Wilson W.R. Failuer to recover Chlamydia trachomatis from open lung biopsy tissue of adult immunosuppressed patients // Chest.
– 1984.
– Vol. 86.
– P. 649.

11.Gay G.D., Smith T.F., Ilstrup D.M. Comparison of processing techniques for detection of Pneumocystis carinii cystis in open lung biopsy specimens // J. Clin. Microbiol.
– 1985.
– Vol. 21.
– P. 150 - 151.

12.Grayston J.T. Chlamydia pneumoniae, strain TWAR // Chest.
– 1989.
– Vol. 95.
– P. 664 - 669.