Чтение онлайн

1.2 Обнаружение нуклеиновой кислоты

Анализ на нуклеиновые кислоты — предпочтительный метод диагностики инфекции SARS-CoV-2. Процедура тестирования согласно приведенным в наборе инструкциям выглядит следующим образом: Образцы подвергаются предварительной обработке, и вирус подвергается лизису для вычленения нуклеиновых кислот. Три специфических гена SARS-CoV-2, а именно: открытая рамка считывания 1a/b (ORF1a/b), гены нуклеокапсидного белка (N) и белка оболочки (E) — затем амплифицируются по методике количественной ПЦР в реальном времени. Амплифицированные гены обнаруживаются интенсивности флуоресценции. Назовем критерии положительных результатов анализа на нуклеиновые кислоты: Положительный тест на ген ORF1a/b и (или) ген N (ген E).

Одновременное обнаружение нуклеиновых кислот в нескольких видах образцов может повысить точность диагностирования. Примерно у 30–40 % пациентов с подтвержденным положительным анализом на нуклеиновую кислоту в дыхательных путях обнаружена вирусная нуклеиновая кислота в крови, а примерно у 50–60 % пациентов с подтвержденным положительным анализом на нуклеиновую кислоту в дыхательных путях обнаружена вирусная нуклеиновая кислота в кале. Однако коэффициент позитивности тестирования на нуклеиновые кислоты в образцах мочи не очень высок. Комплексное тестирование образцов из дыхательных путей, кала, крови и других видов образцов помогает повысить диагностическую чувствительность в случае подозрения на болезнь, улучшить контроль за эффективностью лечения и руководство изоляционными мероприятиями после выписки.

Культивирование вируса должно осуществляться в лаборатории с подтвержденным 3-м уровнем биологической безопасности (BSL-3). Вкратце процедуру можно описать следующим образом: У пациента берутся свежие образцы мокроты, кала и другие пробы, после чего они инокулируются в клетках Vero-Е6 для культивирования вируса. Цитопатический эффект (ЦЭ) наблюдается через 96 часов. Обнаружение вирусной нуклеиновой кислоты в культуральной среде свидетельствует об успешном культивировании. Определение титра вируса: После последовательного растворения вирусного посевного материала в 10 раз TCID50 определяется микроцитопатическим методом. В противном случае жизнеспособность вируса определяется бляшкообразующей единицей (БОЕ).

После заражения SARS-CoV-2 образуются специфические антитела. К методам определения сывороточных антител относятся иммунохроматография с использованием коллоидного золота, твёрдофазный иммуноферментный анализ, иммунохемилюминесценция и др. Положительный результат анализа на антигенспецифичный сывороточный титр класса IgM — или если титр специфических антител класса IgG в фазе выздоровления в >4 раза выше по сравнению с острой фазой — можно использовать в качестве диагностических критериев у пациентов с подозрением на COVID-19 и отрицательным результатом обнаружения нуклеиновых кислот. Во время диспансерного наблюдения IgM обнаруживается через 10 дней после появления симптомов, IgG — через 12. Вирусная нагрузка постепенно уменьшается по мере увеличения уровня сывороточных антител.

Рекомендуется сдавать анализы на С-реактивный белок, прокальцитонин, ферритин, D-димер, общее содержание и субпопуляции лимфоцитов, интерлейкине IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a, INF-y и другие индикаторы воспаления и иммунного статуса, которые могут помочь оценить клиническое течение болезни, оповещать о тяжелых и критических состояниях, а также служить основой для формирования стратегий лечения.

У большинства пациентов с COVID-19 нормальный уровень прокальцитонина и существенно повышенный уровень С-реактивного белка. Быстрое и существенное повышение уровня С-реактивного белка указывает на возможность вторичной инфекции. В тяжелых случаях уровень D-димера существенно возрастает, что потенциально служит фактором риска для неблагоприятного прогноза. У пациентов с общим низким количеством лимфоцитов в начале болезни обычно неблагоприятный прогноз. У пациентов в тяжелом состоянии неуклонно уменьшается количество лимфоцитов периферической крови. Уровень экспрессии IL-6 и IL-10 у пациентов в тяжелом состоянии значительно повышается. Контроль уровня IL-6 и IL-10 помогает оценить риск развития тяжелого состояния.

Пациенты в тяжелом или критическом состоянии подвержены риску развития вторичных бактериальных или грибковых инфекций. Следует квалифицированно собирать образцы в очаге инфекции для бактериологического или грибкового посева. При подозрении на вторичную легочную инфекцию следует брать образцы мокроты, выделяемой из глубины лёгких, трахейных аспиратов, бронхоальвеолярного лаважа и щёточные образцы для культивирования. У пациентов с высокой температурой следует своевременно брать посев крови. У пациентов с подозрением на сепсис, которым был установлен постоянный катетер, следует брать посевы крови из периферических внутривенных катетеров. Рекомендуется брать у них анализ крови класса G и GM не реже двух раз в неделю, помимо посева на грибы.

Меры по обеспечению биологической безопасности должны определяться исходя из разных уровней риска, связанного с экспериментальным процессом. Индивидуальная защита должна соответствовать требованиям к защите в лабораториях BSL-3 применительно к взятию образцов из дыхательных путей, обнаружению нуклеиновой кислоты и работам по культивированию вируса. Индивидуальная защита в соответствии с требованиями к защите в лабораториях BSL-2 обязательна при взятии биохимических, иммунологических и других стандартных лабораторных анализов. Образцы должны транспортироваться в специальных контейнерах и боксах, отвечающих требованиям к биобезопасности. Все лабораторные отходы должны строго стерилизоваться в автоклаве.

Торакальная томография чревычайно важна в диагностике COVID-19, контроле терапевтической эффективности и оценки готовности пациента к выписке. Настоятельно рекомендуется КТ в высоком разрешении. Портативная рентгенография грудной клетки подходит обездвиженным пациентам в критическом состоянии. КТ для начального обследования пациентов с COVID-19 обычно выполняется в день госпитализации, а в случае недостижения идеальной терапевтической эффективности может быть повторена через 2–3 дня. Если после лечения симптомы не изменились или стали менее выраженными, КТ грудной клетки может быть повторена через 5–7 дней. Пациентам в критическом состоянии рекомендуется ежедневно выполнять портативную рентгенографию грудной клетки в плановом порядке.

На ранних стадиях COVID-19 часто обнаруживаются многоочаговые тени или субплевральные фокусы уплотнения по типу «матового стекла», расположенные на периферии лёгких, в субплевральной зоне и обеих нижних долях на снимках КТ грудной клетки. Длинная ось поражённого участка по большей части параллельна плевре. В некоторых случаях субплевральных фокусов уплотнения по типу «матового стекла» наблюдаются междольковые септальные утолщения и внутридольковые интерстициальные утолщения, которые выглядят как субплевральный сетчатый узор, а именно: рисунок «булыжной мостовой». В небольшом числе случаев могут наблюдаться одиночные, локальные поражения или узелковое (очаговое) поражение, распределенное в соответствии с бронхом, с периферийными изменениями в виде субплевральных фокусов уплотнения по типу «матового стекла». Прогрессирование заболевания наблюдается по большей части в течение 7—10 дней, при этом нарастает и увеличивается плотность поражённых участков по сравнению с предыдущими снимками, а также наблюдаются уплотнённые поражённые участки с признаком воздушной бронхограммы. В критических случаях может наблюдаться дальнейшее разрастание уплотнения, когда плотность всего лёгкого в целом демонстрирует повышенную замутнённость, иногда это называется «белое лёгкое». После того, как состояние пациента улучшится, субплевральные фокусы уплотнения по типу «матового стекла» могут полностью рассосаться, а некоторые уплотнённые поражённые участки оставят после себя фиброзные полоски или субплевральный сетчатый узор. Пациенты с несколькими дольковыми поражениями, особенно с обширными поражёнными участками, должны оставаться под наблюдением на предмет обострения заболевания. Пациенты с характерными лёгочными проявлениями заболевания на снимках КТ должны быть изолированы и постоянно сдавать анализы на нуклеиновую кислоту, даже если анализ на нуклеиновую кислоту SAR-CoV-2 показал отрицательный результат.

Характерные признаки COVID-19 на снимках КТ:

Рис. 1, Рис. 2: очаговые субплевральные фокусы уплотнения по типу «матового стекла»;

Рис. 3: узлы и очаговая экссудация;

Рис. 4, Рис. 5: многоочаговые уплотнения на пораженных участках;

Рис. 6: диффузные уплотнения, «белое лёгкое».

Бронхоскопия с гибким видеоэндоскопом является универсальным методом, который прост в использовании и хорошо переносится у пациентов, инфицированных COVID-19, находящихся на искусственной вентиляции. Его применение включает в себя:

(1) Сбор образцов из нижних дыхательных путей (т. е. мокроты, эндотрахеального аспирата, бронхоальвеолярного лаважа) для выявления SARS-CoV-2 или других возбудителей помогает определить выбор соответствующих антимикробных препаратов, что может привести к благоприятным клиническим результатам. Наш опыт показывает, что образцы из нижних дыхательных путей с большей вероятностью могут быть положительными при анализе на SAR-CoV-2, чем образцы верхних дыхательных путей.

(2) Возможно использование этого метода для локализации очага кровотечения, купирования кровохарканья, удаления мокроты или сгустков крови; если очаг кровотечения выявлен с помощью бронхоскопии, то с помощью бронхоскопа можно проводить местную инъекцию холодного физиологического раствора, эпинефрина, вазопрессина или фибрина, а также лазерное лечение.