Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей
Шрифт:
Размороженную клубнику положим в полиэтиленовый пакет и добавим туда ананасовый сок (желательно свежий), содержащий большое количество фермента бромелина. Этот фермент является протеазой (протеиназой), то есть способен разрушать белки. От белков нам желательно избавиться, потому что некоторые из них могут разрушать ДНК. Концентрированная протеаза из ананаса используется для удаления омертвевшей ткани после сильных ожогов, а также для маринования мяса на шашлыки (мясо становится более мягким). Есть предположение, что ананасовый сок благодаря столь высокому содержанию протеаз улучшает пищеварение.
Содержимое пакета нужно как следует перемешать и размять, чтобы ДНК оказалась в растворе. От мякоти придется избавиться — для этого можно использовать марлю или дуршлаг. Жидкость, отфильтрованную от мякоти, переливаем в стакан и достаем очень крепкий алкоголь. Желательно, чтобы в нем было больше 70 % спирта. Это может быть крепкий абсент, американская водка Devil's Springs (75,5 % этанола), спирт Everclear (бывает с содержанием спирта 75,5 % и 90 %) или ром Bacardi 151 (75,5 % этанола). Внимание! Чрезмерное употребление алкоголя вредит вашему здоровью!
Алкоголь нужно добавлять в коктейль очень медленно, по краешку стакана. Желательная высота слоя спирта — несколько сантиметров. Ни в коем случае спирт не должен перемешиваться с соком. В спирте ДНК не растворяется, поэтому, если все сделать аккуратно, получится двухслойный напиток, а между слоями сформируются беловатые сгустки ДНК. Их можно подцепить палочкой и съесть. Все совершенно натурально!
Конечно, в лаборатории используют гораздо более стандартизованные и эффективные методы выделения ДНК. Быструю заморозку клеток можно осуществлять в жидком азоте. Кроме того, для разрушения клеточных оболочек можно использовать детергент (вроде моющего средства), например раствор Triton X-100. В детергент иногда добавляют соль, которая помогает ДНК слипаться. Вместо протеаз из ананасового сока для разрушения белков используют чистую протеиназу (чаще всего протеиназу К). Вместо дорогих алкогольных напитков берут обычный спирт. После добавления спирта раствор обычно охлаждают и помещают в центрифугу, где пробирка начинает вращаться со скоростью около десяти тысяч оборотов в минуту. Центробежная сила приводит к тому, что осадок (из ДНК) оказывается на нижней стенке пробирки. Потом жидкость из пробирки удаляется, а ДНК так и остается на дне. Подобные эксперименты в ряде стран проводят даже дети. Когда они подрастут, им разрешат использовать методы выделения ДНК для взрослых — с Bacardi и абсентом.
С генной инженерией не все так просто, как с выделением ДНК. Вам потребуется объект, который вы хотите модифицировать, например бактерия или растение, один из множества инструментов для генной модификации и, собственно, та конструкция из ДНК, которую вы хотите перенести. В качестве примера попробуем создать флуоресцирующую бактерию. Доктор М, а также другие ученые до него уже нашли для нас гены, которые кодируют флуоресцентные белки, и выложили их последовательности нуклеотидов в открытые базы данных, что существенно облегчает поставленную перед нами задачу.
В 1961 году японский ученый Осаму Симомура выделил из медузы рода Aequorea красивый биолюминисцентный белок, светящийся синим [300] . Позже было установлено, что у медузы есть еще один белок, работающий с ним в паре. Мы его уже упоминали в предыдущих главах. Этот белок поглощает свет в синем диапазоне, а излучает в зеленом. Его назвали GFP (green fluorescent protein, или зеленый флуоресцентный белок). Если биолюминисцентным белкам нужен исходный продукт (субстрат), с которым они вступают в химическую реакцию для получения света, то GFP в таком субстрате не нуждается. Как это часто бывает в области фундаментальных научных исследований, в последующие тридцать лет GFP оставался практически бесполезным и интересовал лишь узких специалистов, изучающих механизмы его флуоресценции. До тех пор, пока внезапно этому белку не нашлось важнейшее применение, перевернувшее наши представления о молекулярной биологии.
300
Shimomura O. et al.: Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 1962, 59:223–39.
В 1992 году американский ученый Дуглас Прэшер с соавторами установили последовательность гена GFP [301] . К сожалению, ученому самым обидным образом не хватило финансирования, чтобы после продолжить изучение гена. Прэшер едва сводил концы с концами: какое-то время он даже ездил на машине с надписью «ученому нужна работа» и принимал пожертвования. Тем временем геном GFP независимо заинтересовались ученые Мартин Чалфи и Роджер Цянь. Прэшер, полагая, что сам с изучением GFP не справится, согласился передать ген коллегам для проведения дальнейших экспериментов.
301
Prasher D.C. et al.: Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 1992, 111(2):229–33.
Чалфи тоже не купался в деньгах, но обладал изобретательностью, которая очень помогла ему в исследовательской работе. Например, его лаборатория не могла позволить себе флуоресцентный микроскоп (чтобы наблюдать свечение GFP внутри отдельных клеток), поэтому Чалфи приглашал к себе торговцев лабораторным оборудованием, брал у них микроскопы на «испытательный срок», делал нужные снимки и анализы, а потом возвращал приборы обратно, так ничего и не купив.
В 1994 году Чалфи и его коллеги, включая Прэшера, опубликовали в журнале Science статью о том, что с помощью генной инженерии можно соединять ген GFP с другими генами живых организмов, а по свечению определять локализацию кодируемых ими белков [302] . Впоследствии благодаря GFP стало возможно увидеть под микроскопом, как развивается нервная система, как клетки поджелудочной железы, производящие гормон инсулин, организуются в ходе эмбрионального развития, как белки транспортируются в клеточное ядро или из ядра и вообще из одной части клетки в другую, как раковые клетки распространяются по телу человека и так далее.
302
Chalfie M. et al.: Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 1994, 263(5148):802–5.
Тем временем сотрудники лаборатории Цяня обнаружили в гене GFP мутации, из-за которых белок становился более ярким [303] , а также мутации, меняющие цвет флуоресценции белка. Благодаря его исследованиям арсенал ученых пополнился желтыми, оранжевыми, красными и другими флуоресцентными белками и их генами. Впоследствии решение Прэшера «поделиться» геном GFP с коллегами принесло великую пользу науке, но стоило ученому Нобелевской премии, на вручении которой он присутствовал почетным гостем, а не лауреатом. Премию за GFP разделили Цянь, Чалфи и Симомура, люди, успевшие внести наибольший вклад в его изучение, что не отменяет заслуг первооткрывателя гена. Последовательность исходного гена GFP Прэшера из оригинальной публикации вы можете увидеть ниже.
303
Heim R. et al.: Improved green fluorescence. Nature 1995, 373(6516):663–4.
Кроме мутационного подхода для создания новых форм светящихся белков, который использовали в лаборатории Цяня, есть еще один способ — поиск уже существующих в природе генов флуоресцентных белков (как это делал Доктор М). С этим подходом преуспели в лаборатории академика Сергея Лукьянова из Института биоорганической химии РАН. Ученые открыли ярко-зеленый флуоресцентный белок на щупальцах актинии Anemonia majano, желтозеленый белок на щупальцах мягкого коралла рода Zoanthus, сине-зеленый белок на полосах и красный белок на пятнах дисков «грибного коралла» Discosoma striata и другие белки [304] . Позже эксперименты с различными флуоресцентными белками и их мутантами позволили создать белок, со временем меняющий цвет флуоресценции от зеленого к красному [305] . При помощи этого белка можно изучать, как меняется локализация или концентрация в клетке других белков, соединенных с такими светящимися «молекулярными часами».
304
Matz M.V. et al.: Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol 1999, 17(10):969–73.
305
Terskikh A. et al.: «Fluorescent timer»: protein that changes color with time. Science 2000, 290(5496):1585–8.
Еще одну замечательную идею с использованием флуоресцентных белков придумала группа молекулярных биологов из Гарварда во главе с Джефом Лихтманом и Джошуа Сейнсом. В 2007 году они опубликовали в журнале Nature статью о новом методе исследования связей между нервными клетками мозга — Brainbow™ (от слов brain — «мозг» и rainbow — «радуга», то есть «мозговая радуга»). Метод основан на том, что в результате особой рекомбинации в отдельных нервных клетках генетически модифицированного организма оказывается свой уникальный набор генов флуоресцентных белков. Разные соотношения красных, зеленых и синих белков создают уникальные цвета, поэтому отдельные нейроны и их отростки окрашиваются по-разному. Это позволяет создавать удивительной красоты изображения структур мозга и видеть, какие нервные клетки соединены отростками.
Но вернемся к нашей текущей задаче — создать работающую плазмиду с флуоресцентным геном. Сначала мы спланируем ее на компьютере, а потом рассмотрим, как получить соответствующую последовательность ДНК в пробирке. В конце мы перенесем плазмиду в бактерию. Давайте выберем предложенный ген GFP или его аналог, цвет и яркость которого нам больше подходят, и последуем дальше.
Кроме гена GFP, нам понадобится ген, придающий бактерии устойчивость к какому-нибудь антибиотику. Такие гены могут кодировать белки, разрушающие или инактивирующие антибиотик, не впускающие его в клетку и так далее. Примеров и механизмов устойчивости известно множество, причем от разных антибиотиков защищают разные механизмы. После того как мы генетически модифицируем наши бактерии, мы захотим избавиться от тех, которые модифицировать не удалось, и антибиотик нам в этом поможет.