Чтение онлайн

Генная пушка — это универсальный метод, позволяющий доставлять ДНК (или РНК) практически в любые клетки, будь то клетки животных, растений или бактерий. Основным недостатком метода до недавнего времени считалась стоимость генной пушки, которая могла доходить до 15 тысяч долларов. Однако «биохакер» Рюдигер Тройок создал ее упрощенный аналог ценой всего в 50 евро. Сначала он попробовал смастерить пушку, в основе которой лежали найденная в лесу деревянная палка, электрические клапаны (их он откопал в каком-то мусорном баке), капсула для накачивания велосипедных шин со сжатым углекислым газом, дешевый микроконтроллер и пластиковые трубки. Ствол пушки был сделан из корпуса пишущей ручки и с помощью трубки соединен с клапаном, внутри которого были расположены частички золота, смазанные ДНК и помещенные на пластиковый носитель.

Когда первый прототип не выдержал созданного в нем давления и сломался, Тройок просто соединил ствол своей генной пушки с распылителем для взбитых сливок (баллончик с веселящим газом, находящимся под давлением) — и готово. По заявлению Тройока, устройство могло придать частицам достаточную скорость для проникновения внутрь клеток лука. Конечно, эта пушка далека от совершенства, но сделать недорогую высококачественную генную пушку в принципе возможно, и скоро они появятся в широком доступе, если на них будет увеличиваться спрос.

Еще одна особенность генной пушки заключается в том, что фрагменты ДНК могут попадать в самые разные части клетки. В том числе в митохондрии, хлоропласты и другие внутриклеточные структуры. Это нежелательно, если мы хотим модифицировать ядерную ДНК клетки, но полезно, если мы хотим внести ген в сами митохондрии или хлоропласты [308] . Нежелательный эффект — обстрелянные из генных пушек клетки могут повреждаться. Какие-то клетки получат частички с ДНК, а какие-то мы просто повредим напрасно. Некоторым клеткам не достанется ни одной молекулы ДНК, а другим десятки. Наконец, ДНК встроится в геном лишь небольшой части клеток. Впоследствии придется тщательно отбирать те уцелевшие клетки, в которых генная модификация прошла успешно.

Обычно для генной инженерии растений выбираются особые клетки, которые называются каллусом. Каллус помещают в питательную среду, а потом подвергают обстрелу из генной пушки. Клетки каллуса многофункциональные, неспециализированные, из них можно получить целое растение путем вегетативного размножения. Если растение получено из генетически модифицированной клетки каллуса, оно будет целиком генетически модифицированным и станет давать соответствующее потомство.

В основе еще одного метода генной инженерии лежит использование почвенной агробактерии Agrobacterium tumefaciens. Ключевую роль в процессе генной модификации растительных клеток играет Ti– плазмида этой бактерии. Ее можно сравнить с маленькой передвижной подпольной лабораторией по генной инженерии, которую бактерия таскает с собой. Ti– плазмида кодирует целый арсенал белков, необходимых для доставки ДНК в растительную клетку, а также содержит особый участок, который называется Т-ДНК. Когда бактерия оказывается рядом с растительной клеткой, между ними образуется канал. Тем временем в бактерии создается копия Т-ДНК и синтезируются белки, которые связываются с Т-ДНК, помогают ей пройти по каналу внутрь растительной клетки, а дальше в ее ядро, где они создают разрезы в геномной ДНК растения и интегрируют Т-ДНК в одну из хромосом.

Бактериальные белки переносят не любую ДНК, а именно Т-ДНК, потому что она содержит особые последовательности, которые узнаются вышеупомянутыми белками Ti-плазмиды. В природе Т-ДНК содержит набор генов, которые, оказавшись в растительном геноме, заставляют клетки активно делиться и производить для бактерий питательные вещества. В результате на зараженных тканях растения образуются опухоли — корончатые галлы (в чем-то похожие на клубеньки). Но не стоит их путать с раковыми опухолями — там совсем другие молекулярные механизмы.

Как бы мы могли использовать замечательную способность агробактерий переносить свои гены в геномы растений? Можно взять Ti– плазмиду и убрать из Т-ДНК гены, вызывающие появление корончатых галлов [309] , а на их место вставить, например, ген Cry-токсина, который делает растение устойчивым к вредителям, или какой-нибудь другой ген, повышающий сельскохозяйственную ценность растения. Такую модифицированную Ti– плазмиду мы можем поместить внутрь агробактерии, а дальше агробактерия сама сделает свое дело — перенесет Т-ДНК в растительную клетку. Прелесть технологии в том, что Т-ДНК встраивается прямо в хромосому растения. Когда растительная клетка будет делиться, вставка будет размножаться и передаваться ее потомкам. Нам остается лишь использовать способность растений к вегетативному размножению, чтобы вырастить из небольшого числа клеток взрослый генетически модифицированный организм.

Стоит подчеркнуть несколько моментов, которые часто вызывают путаницу. Внутри растительных клеток ни на каком из этапов не присутствует вся бактериальная Тг-плазмида. Присутствует только ее часть — Т-ДНК. Вставка наследуется и передается потомкам растения даже при половом размножении. Вставка, используемая генными инженерами, больше не содержит опухолевых генов, поэтому у генетически модифицированных растений опухоли не появятся.

Для генной инженерии можно использовать не только бактерии и их плазмиды, но и вирусы. В предыдущих главах мы обсуждали способность некоторых вирусов встраивать копии своего генома в геномы клеток различных организмов. Но вирусы чаще всего вредны, а нам хочется переносить гены с минимальными побочными эффектами. Решить эту задачу помогает то обстоятельство, что вирусные частицы легко получаются из отдельных компонентов. Для создания вируса можно отдельно синтезировать вирусные белки (в каких-нибудь клетках), отдельно произвести копии его ДНК (если это вирус с ДНК-геномом) или РНК (если его геном из РНК), а потом смешать все это вместе в пробирке.

В вирусной ДНК (или РНК) присутствуют определенные последовательности нуклеотидов, необходимые для сборки вирусных частиц. Такие последовательности — что-то вроде «кодового слова». Зная «кодовое слово», мы можем снабдить им любую последовательность ДНК (или РНК) — например, нужный нам ген. Желательно только, чтобы конечная генетическая конструкция имела размеры, примерно соответствующие размеру вирусного генома. Мы можем отдельно синтезировать обрамленные «кодовыми словами» нужные нам гены, а потом смешать их с вирусными белками, необходимыми для сборки вирусных частиц. Полученные частицы будут взаимодействовать с клетками и доставлять в них нашу генетическую конструкцию, но не будут полноценными вирусами, так как в них нет опасных вирусных генов (а только необходимые нам). Зараженные клетки не будут производить новые вирусные частицы.

Напоследок у нас осталось еще одно, пожалуй, наиболее интересное и сложное оружие в руках генного инженера, за открытие которого, несомненно, дадут Нобелевскую премию. Я уже упоминал о нем, рассказывая про способность бактерий модифицировать свой собственный геном. Речь идет о CRISPR-системе. В 2000 году группа испанских био-информатиков обнаружила загадочное явление — скопление похожих друг на друга (повторяющихся) последовательностей в геномах многих прокариот [310] . Между повторяющимися последовательностями находились уникальные участки ДНК длиной в несколько десятков нуклеотидов, которые ученые назвали спейсерами. Представьте шахматную доску, где в одном ряду на черных клетках стоят различные фигуры, а на белых — одинаковые пешки. Повторяющиеся элементы оказались похожими даже в очень разных группах бактерий и архей, поэтому было выдвинуто предположение, что эти последовательности играют важную, но пока неизвестную роль в жизни прокариотических клеток.

В 2005 году три группы исследователей независимо обнаружили, что бактерии направленно встраивают небольшие фрагменты чужеродной ДНК (например, куски геномов бактериофагов) в свой геном в виде тех самых спейсеров [311–313] . Оказалось, что встраивание происходит в определенном месте бактериального генома, которое получило название «CRISPR-кассета». Но для чего это бактериям? Группа эволюционного биолога Евгения Кунина (одного из самых цитируемых современных ученых и автора книги «Логика случая») заинтересовалась вопросом о функциях спейсеров. Исследователи проанализировали имеющиеся генетические последовательности CRISPR-кассет и в 2006 году предсказали, что мы имеем дело с системой бактериального иммунитета [314] .

Как потом выяснилось, группа Кунина была права не только насчет функции CRISPR-кассет, но и насчет механизма работы бактериального иммунитета. Они предположили, что этот механизм похож на РНК-интерференцию эукариот. Напомню, что при РНК-интерференции короткие фрагменты чужеродной РНК используются особыми клеточными белками для поиска длинных чужеродных молекул РНК и их уничтожения. Аналогично CRISPR-система бактерий использует короткие фрагменты «направляющих РНК», синтезированных со спейсеров, для обнаружения полноразмерных молекул ДНК бактериофагов.