Чтение онлайн

В регуляции генной экспрессии, по-видимому, участвуют локальные регуляторные элементы, либо примыкающие к отдельным генам, либо находящиеся в них самих. Транскрипционные единицы содержат не только кодирующие последовательности и интроны, но также некодирующие последовательности, примыкающие к генам на 5'- и 3'-концах. Существование регуляции на уровне и транскрипции, и процессинга свидетельствует о том, что локальные регуляторные элементы включены в транскрипционные единицы. Некоторые из первичных локальных регуляторных элементов представлены сайтами, которые должны распознавать поступающие извне регуляторные сигналы, специфически индуцирующие или репрессирующие транскрипцию данного гена. В их число входят также: сайт для связывания РНК-полимеразы, сайт, инициирующий транскрипцию; сайт, определяющий окончание транскрипции; сайты, определяющие процессинг; сайты, в которых происходит разрезание и сращивание при процессинге, и сайты внутри самой мРНК, обеспечивающие ее присоединение к рибосоме и начало трансляции.

Существование функционального локального контролирующего элемента, примыкающего к гену, показали генетическими методами Човник (Chovnick) и его сотрудники для локуса rosy у дрозофилы. Локус rosy был первоначально определен как локус, в котором возникает рецессивная мутация, обусловливающая коричневатый цвет глаз. Эта мутантная окраска вызвана недостатком дрозоптерина - пигмента, обусловливающего красный цвет глаз; недостаток пигмента создается отсутствием фермента ксантиндегидрогеназы. Мутации в локусе rosy вызывают структурные изменения белка ксантиндегидрогеназы. Човник и его сотрудники определили протяженность гена ксантиндегидрогеназы, составив карту внутригенных рекомбинаций очень большого числа мутаций в локусе rosy. Существуют также генные изменения, оказывающие влияние на уровень экспрессии этого гена. Одно из них было нанесено на карту как предположительный прилегающий регуляторный элемент, активный в цис– положении. Было установлено, что этот мутантный вариант продуцирует большее количество ксантиндегидрогеназы, чем обычно, и что продуцируемый белок отличается по электрофоретической подвижности. Как показал анализ внутригенных рекомбинантов, регуляторный сайт отделен от «электрофоретического» сайта, находящегося в самом структурном гене ксантиндегидрогеназы. На генетической карте регуляторный сайт лежит на расстоянии, соответствующем 3000 пар нуклеотидов, от одной из границ структурного гена, установленной генетическими методами. Хотя этот мутантный сайт, казалось бы, расположен очень далеко от структурного гена ксантиндегидрогеназы, возможно, что на самом деле сайт инициации транскрипции находится не так уже далеко от мутантного регуляторного сайта. Вполне возможно, что сайт инициации транскрипции по аналогии с ситуацией для генов белков хориона, схематически представленной на рис. 10-7, находится вблизи от регуляторного сайта и отделен от структурного гена, определенного генетическими методами, большим нитроном.

Создание методов клонирования рекомбинантной ДНК и секвенирования ДНК сделало возможным (и модным) поиск локальных регуляторных сайтов в последовательностях ДНК, примыкающих к структурным генам.

Было обнаружено некоторое число потенциальных регуляторных сайтов. Они схематически изображены на рис. 11-7, ни котором показана идеализированная транскрипционная единица млекопитающих и составляющие ее сигнальные последовательности. На этой схеме показана также организация участков, расположенных выше точки начала транскрипции, у рано экспрессируемых генов вируса SV40 млекопитающих и гена, кодирующего гистон Н2А у морского ежа. Оба участка содержат регуляторные сайты, расположенные на 200 пар нуклеотидов выше точки начала транскрипции. Сам структурный ген начинается с сайта инициации, с которого фактически и начинается транскрипция. Этому сайту соответствует 5'-конец мРНК; в мРНК он модифицирован характерным основанием 7-метилG5'ррр, которое образует кэп, играющий важную роль в трансляции. Инициирующая последовательность, изображенная на рис. 11-7, - это обобщенная последовательность, выведенная путем сопоставления инициирующих последовательностей нескольких генов. На самом деле эти последовательности сильно варьируют. В них имеется несколько внутренних сигнальных последовательностей, в том числе сайт начала трансляции, сигналы сплайсинга на границах между нитронами и кодирующими последовательностями и сайты, определяющие терминацию транскрипции и добавление полиадениловых фрагментов к 3'-концу мРНК.

Рис. 11-7. Сигнальные последовательности, ассоциированные с генами эукариот. Вверху представлена идеализированная транскрипционная единица млекопитающих. ТАТА-блок, который, возможно, участвует в связывании РНК-полимеразы, лежит у 5'-конца гена. Транскрипция начинается с сайта кэпа, который лежит на расстоянии примерно 30 пар нуклеотидов. Кодирующие последовательности показаны черным; единственный показанный на схеме интрон покрыт пунктиром. К внутренним сигналам относятся сайты сплайсинга и сайты терминации и аденилирования. На схеме раннего промоторного участка вируса SV40 показаны две последовательности из 70 пар оснований (заштрихованы), расположенные на расстоянии 116 нуклеотидных пар от сайта начала транскрипции в сторону 5'-конца. Эти последовательности необходимы для экспрессии раннего участка вируса SV40 in vivo. На нижней схеме показана начальная область (с 5'-конца) для одного из членов кластера гистоновых генов морского ежа. Участок А содержит эволюционно консервативную последовательность, участок В - ТАТА-блок, а участок С - сайт кэпа. Воздействие делений этих участков на транскрипцию рассмотрено в тексте. (Lewin, 1980; Benoist, Chambon, 1981; Mathis, Chambon, 1981; с изменениями. Grosschedl, Birnstiel, 1980.)

Особый интерес для понимания регуляции транскрипции генов в процессе развития представляют, однако, регуляторные сайты, расположенные выше точки начала транскрипции. Наиболее хорошо известна последовательность ТАТАААА (ТАТА-блок, или ТАТА-бокс), лежащая на расстоянии примерно 30 пар нуклеотидов от точки начала транскрипции. Эта последовательность очень сходна с сайтом узнавания РНК-полимеразы, впервые обнаруженным Прибновом (Pribnow) у бактерий и необходимым для транскрипции бактериальных генов. ТАТА-блок необходим для транскрипции генов эукариот в системе in vitro, но, как показали эксперименты, проведенные недавно Бенуа и Шамбоном (Benoist, Chambon), Матисом и Шамбоном (Mathis, Chambon) и Гросшедлом и Бирнстилом (Grosschedl, Birnstiel), при транскрипции in vivo в ТАТА-блоке нет необходимости. Если ввести в ооциты Xenopus клонированные гены, они точно транскрибируются. Можно вызвать делеции определенных участков и ввести в ооциты такие модифицированные гены. При этом можно определить как скорость транскрипции, так и последовательность образующейся РНК. Путем таких экспериментов было установлено, что гены, из которых был удален ТАТА-блок, транскрибируются почти с такой же скоростью, как обычно, но что транскрипция инициируется в нескольких сайтах, которые в нормальных генах не используются. Таким образом, последовательность ТАТА определяет сайт инициации, с которого РНК-полимераза начинает транскрипцию; однако этот сайт не является абсолютно необходимым для связывания РНК-полимеразы или для начала транскрипции.

На самом деле модуляция транскрипции зависит от регуляторных сайтов, расположенных на целых 200 пар нуклеотидов выше сайта инициации транскрипции. Бенуа и Шамбон обнаружили, что у вируса SV40 этот участок имеет сложную структуру. Он содержит пять блоков, богатых GC-последовательностями. Два из этих блоков включены в две тандемно повторяющиеся последовательности, состоящие из 72 пар нуклеотидов каждая и расположенные примерно на 150 пар нуклеотидов выше сайта начала транскрипции. Эксперименты, в которых эти тандемные последовательности удаляли из ДНК, показали, что они необходимы для транскрипции in vivo.

У гена, кодирующего гистон Н2А морского ежа Psammechinus miliaris, также имеются регуляторные последовательности, удаленные от сайта инициации. Участок гена Н2А, расположенный вверх от точки начала транскрипции (рис. 11-7), можно разделить на несколько различных функциональных участков. Участок С содержит сайт инициации. На расстоянии примерно 30 пар нуклеотидов от сайта инициации в участке В имеется ТАТА-блок. На расстоянии примерно 35 пар нуклеотидов от ТАТА-блока, находится участок А, содержащий последовательность из 30 нуклеотидов, несущую на каждом конце короткие инвертированные последовательности. Эта последовательность из 30 нуклеотидов специфична для гена Н2А и эволюционно консервативна. Участок начинается с 110-й пары нуклеотидов выше сайта инициации и тянется дальше еще на 340 пар нуклеотидов. Этот сегмент богат АТ-парами.

Гросшедл и Бирнстил провели испытание функциональной роли каждого из участков, лежащих выше точки начала транскрипции, сравнивая транскрипцию клонированных генов Н2А, несущих делеции в этих участках, с транскрипцией немодифицированных клонов Н2А. Делеция участка, содержащего ТАТА-блок, вызывала понижение скорости транскрипции гена Н2А в 5 раз и приводила к тому, что транскрипция начиналась с новых сайтов инициации. Делеция консервативного блока из 30 пар нуклеотидов в участке А привела к ускорению транскрипции вдвое. Делеция большого участка Е, богатого АТ-парами, привела к замедлению транскрипции гена Н2А в 15-20 раз. Регуляторная функция этого участка может определяться либо его составом, либо наличием в нем какой-то специфической последовательности. Для проверки этих гипотез Гросшедл и Бирнстил создали модифицированный клон, содержащий участок Е, но с инвертированной последовательностью. Проверка на транскрипцию дала неожиданный результат: у ДНК, содержавшей инвертированный участок, уровень транскрипции оказался в 5 раз выше. Наряду с образованием обычных Н2А-транскриптов образовывались и транскрипты, на 5'-конце которых имелся добавочный фрагмент длиной в 90 нуклеотидов.

Регуляторную роль могут нести не только элементы, расположенные выше точки начала транскрипции. Исследования, проведенные Саконджу и др. (Sakonju et al.) и Богенхагеном и др. (Bogenhagen et al.), показали, что у Xenopus делеция начального участка гена 5S-рибосомной РНК не оказывает никакого влияния на транскрипцию. Даже делеция большей части самого структурного гена не производит никакого действия. Контроль транскрипции осуществляется здесь последовательностью, которая охватывает примерно 50 нуклеотидных пар внутри структурного гена. 5S-ген транскрибируется иной РНК-полимеразой (полимераза III), нежели гены, продуцирующие мРНК (полимераза II), и этим, возможно, объясняется различие в местоположении регуляторных сайтов. В общем и целом результаты исследований регуляторов генной экспрессии, примыкающих к генам, еще не вполне понятны; однако они указывают на существование разнообразных элементов, расположенных по соседству с генами и принимающих участие в количественной регуляции транскрипции и в уточнении места ее начала.

Несколько причудливый характер организации генов у эукариот, выявленный в результате современных исследований на молекулярном уровне, делает необходимым дополнить приведенное в начале этой главы высказывание Моргана о том, что эволюция требует не увеличения числа генов, а новых генов. Сама проблема значений С по большей части легко разрешается и перестает быть парадоксом. Сателлитная ДНК, семейства умеренно-повторяющихся последовательностей и интроны - все это сильно уменьшает долю генома, приходящуюся на кодирующие участки. Эти и другие элементы генома составляют большую часть его ДНК, причем количество их может сильно различаться у родственных организмов. Такое неожиданное разрешение С-парадокса выдвинуло еще более важную проблему. Разнообразие установленных и потенциальных регуляторных элементов поразительно; мы только начинаем постигать их функции. Увеличение числа генов и приобретение новых генов, возможно, участвует в эволюции большинства групп эукариот, однако главную роль в ней играют модификации изощренных регуляторных механизмов. Эволюционные изменения генной экспрессии, вероятнее всего, происходили путем изменений в отдельных регуляторных элементах или путем транспозиции генов и регуляторных элементов, что создавало возможность для новых ассоциаций белковых доменов и новых ассоциаций между генами и примыкающими к ним регуляторами. Такие изменения эффективны лишь потому, что локальные регуляторные элементы реагируют на сигналы, генерируемые интегрирующими системами, которые управляют экспрессией многочисленных генов, с тем чтобы создавать интегрированные ткани и определять морфогенетические пути.

В 1932 г. знаменитый палеонтолог позвоночных Г. Осборн (Н. F. Osborn) опубликовал статью, озаглавленную «Девять принципов эволюции, открытых палеонтологией», которая преисполнена раздражения по отношению к генетике и генетикам и содержит удивительно догматичные (и ошибочные) формулировки «эволюционных принципов». Типичным их образцом служит следующее утверждение Осборна: «В настоящее время мы можем лишь сказать, что Природа не тратит попусту времени или усилий, рассчитывая на удачу или случай или ставя эксперименты, а стремится прямо и творчески к достижению своих прекрасных целей - созданию адаптивных биомеханизмов». Это поразительное изречение величественно отметает всякое участие в эволюции естественного отбора, использующего отклоняющиеся гены или генетические системы. Оно рисует, возможно, привлекательную для кого-то картину, олицетворяющую Природу, которая создает «перспективных монстров» и вызывает прерывистые эволюционные события по заранее составленному плану. Однако при этом Осборн считал, что эволюция, за исключением изменения меристических признаков, носящего прерывистый характер, протекает с величественной постепенностью при участии длительных непрерывных процессов. Направленность эволюции была ему очевидна в тех случаях, когда какая-либо тенденция, подобно коррелированному увеличению размеров рогов и общих размеров в одной группе вымерших млекопитающих - титанотериев, сохранялась на протяжении всей эволюционной истории данной линии.