Чтение онлайн

И все же, как упоминалось выше, информацию о кишечном микробиоме мы получаем в основном с помощью секвенирования ДНК, которое не учитывает его структуру и функции. Такой дефицит биофизических знаний начал беспокоить меня лет десять назад, когда в мире резко возрос интерес к кишечной микробиоте и я частенько беседовал с уже упомянутой Карен Гиймен. Примерно тогда же я увлекся новыми методами микроскопии, особенно флуоресцентной микроскопией плоскостного освещения (LSFM), которая позволяет быстро получать трехмерное изображение больших полей обзора (в микроскопии большими считают поля диаметром чуть меньше миллиметра). В итоге моя группа сконструировала собственный LSF-микроскоп и начала изучать кишечник живой личинки данио-рерио. Мы понимали, что сможем получить изображения и видео, охватывающие весь кишечник и достаточно четкие, чтобы разглядеть отдельные бактерии. Никто прежде не проводил такую визуализацию позвоночных. Пользуясь преимуществами оптической прозрачности личинок и возможностью выращивать их стерильными, мы позволяли безмикробным рыбам вступить в контакт не более чем с двумя видами микроорганизмов, чтобы без лишних сложностей изучать, как организуются и ведут себя новоселы.

Я рассудил, что, если бы нам не повезло, мы обнаружили бы лишенные отличительных черт скопления бактерий, одинаковые для всех видов и такие же, как в лабораторной пробирке. Тогда мы, возможно, занялись бы измерением скорости роста кишечных бактерий или другим довольно скучным, но потенциально полезным делом.

К счастью, Природа оказалась к нам благосклонна. Первые же микроскопии явили нам поразительное многообразие форм. Одни бактерии плавают свободно, другие сбиваются в группы. Одни предпочитают передний отдел кишечника, другие заселяют в основном задний. Наметились даже очевидные кандидаты в носители физических характеристик, влияющих на работу кишечной экосистемы, что может подкинуть нам идеи, как манипулировать межвидовой конкуренцией и кооперацией микробов.

Почти во всех экспериментах с личинками данио-рерио наша лаборатория использует бактерии – аборигены кишечника этой рыбы. Но в качестве начальной виньетки, иллюстрирующей физические предпосылки динамики микробиома, я опишу эксперимент не с аборигенной, а с патогенной бактерией – холерным вибрионом. Vibrio cholerae активно изучается больше 100 лет, и хотя холера сегодня не опустошает города, как пару веков назад, она все же уносит около 100 тысяч жизней в год11. Я практически и не думал об этой инфекции до одной необычной встречи в «Биосфере-2» – лаборатории, где в начале 1990-х безуспешно пытались создать герметичную экспериментальную экосистему, способную существовать автономно. Там я пообщался с микробиологом Брайаном Хаммером из Технологического института Джорджии и специалистом по микробиому Жуаном Шавьером из Мемориального онкологического центра Слоуна – Кеттеринга в Нью-Йорке. Нет, нас не заперли в бетонном бункере и не заставили выращивать себе пропитание, а просто пригласили на семинар, организованный Исследовательской корпорацией развития науки, небольшой частной компанией, финансирующей научные проекты. («Биосфера-2» теперь туристический объект и площадка для конференций при Аризонском университете, который совмещает все это с проведением экспериментов в уже не герметичных зданиях под стеклянными крышами.) В ходе бесед мы поняли, что все еще мало знаем о средствах, помогающих холерному вибриону освоиться в человеческом кишечнике. Бактерия ведь не вплывает в пустое пространство, а попадает в орган, густонаселенный триллионами резидентных микроорганизмов, среди которых она должна как-то закрепиться.

Брайан много лет изучал поразительный инструмент, которым обладают V. cholerae и многие другие микробы, – шприцеподобное устройство под названием система секреции VI типа (T6SS)12. С помощью этой наномашины бактерии прокалывают соседние клетки и впрыскивают в них токсины [41] . Нас заинтересовало, может ли V. cholerae использовать T6SS для внедрения в кишечник и позволит ли наша комбинация LSF-микроскопии и личинок данио-рерио пролить на это свет. Кроме того, никто никогда не наблюдал, как холерный вибрион колонизирует кишку животного и как вступает в конкуренцию с резидентными бактериями, – вдруг мы увидим нечто захватывающее? Группа Брайана создала несколько штаммов V. cholerae, включая вариант, в котором гены T6SS всегда оставались включенными, а следовательно, вибрион всегда был готов прокалывать соседей (слева на рисунке); у другого варианта «шприц», наоборот, был дефектным, и бактерия не могла никого атаковать (справа).

Группа Жуана проводила эксперименты в чашках Петри, чтобы изучить и визуализировать убийство бактерий бактериями – действо вообще-то довольно красивое. Ну а мы заглядывали внутрь рыбы13.

В простейшем эксперименте по заражению кишечника мы заранее колонизировали стерильную рыбу единственным аборигенным видом бактерий и через 24 часа ввели в окружавшую ее воду один из штаммов V. cholerae. В случае заражения вибрионом с поврежденной системой секреции аборигенные бактерии в кишечнике выглядели так же, как если бы пребывали в одиночестве: они не теряли в численности и формировали плотные колонии. После вторжения захватчика, всегда готового к атаке, аборигенные бактерии гибли: за сутки их популяции сокращались в среднем в 100 с лишним раз, а то и вовсе исчезали. Мы наблюдали, как аборигены теряли контроль над территорией и их колонии перемещались по кишечнику все ниже и ниже, пока не изгонялись из рыбы полностью. На том этапе мы страшно обрадовались очевидной разнице в результатах действия и бездействия T6SS и предположили, что вооруженные холерные вибрионы уничтожают аборигенов, вытесняя их из кишечника. Но мы продолжили наблюдения и обратили внимание на действия самих данио-рерио. Кишечник рыб, как и ваш, периодически сокращается, чтобы перемешивать и продвигать содержимое. Магистрантка Саванна Логан, проводившая эксперименты, заметила, что у рыб, колонизированных всегда боеспособными вибрионами, кишечник сокращался гораздо интенсивнее, чем у стерильных сородичей и рыб, колонизированных любыми другими штаммами V. cholerae. Анализ изображений показал, что интенсивность сокращений у рыб, колонизированных вибрионом с постоянно активной T6SS, была примерно на 100 % выше. Напрашивался вывод, что бактерии атакуют скорее не своих конкурентов, а их хозяина.

Чтобы это доказать, мы снова обратились к сочетанию генной инженерии с микроскопией. Было известно, что фрагмент одного из белков в составе бактериального «шприца» токсичен для микробов-эукариот типа амеб, например, поскольку разрушает филаменты цитоскелета, свойственные всем эукариотическим клеткам, но не представленные в идентичных вариантах у бактерий. Группа Брайана Хаммера создала дополнительный штамм V. cholerae, формирующий в целом функциональный шприц, только без этого токсичного фрагмента. Повторив тот же опыт с заражением рыбы, мы увидели нормальные кишечные сокращения и нормальную, стабильно высокую численность аборигенных кишечных бактерий. Следовательно, холерный вибрион побеждал бактериальных конкурентов, не убивая их, а выдворяя целыми ассоциациями из хозяина с помощью усиления кишечной моторики, обусловленного раздражением стенок токсичными шприцами. Для самих V. cholerae обстоятельства складывались удачнее, поскольку они не склонны к агрегации, подвижны и индивидуалистичны. Так мы установили, что любая бактерия может манипулировать физиологией животного, используя свои шприцеподобные системы. В более широком масштабе наша работа подчеркнула, что физический ландшафт кишечника критически важен для регуляции кишечного микробиома, причем механизмы этого влияния непознаваемы с помощью одних лишь экспериментов в пробирке и анализа ДНК.

Помогут ли наши находки победить холеру? Сомневаюсь. Разумеется, традиционным был бы ответ «да», ведь именно он должен звучать в любых новостях и пресс-релизах; в крайнем случае ответ обязан подводить к мысли, что не за горами победа над любыми болезнями, хоть как-то касающимися открытия. Но в случае с холерой есть препятствие помощнее, чем длинная и непредсказуемая тропинка от фундаментальной лабораторной науки до клинической практики: холеру и без того легко лечить. И главное средство здесь – за исключением самых тяжелых случаев – вода с солями и сахарами. Пугающе высокая смертность от этой болезни в наши дни свидетельствует лишь о плачевном состоянии санитарии и вообще общественного здравоохранения во множестве стран. Зачем же нам тогда изучать у холерного вибриона систему секреции VI типа? Она, конечно же, интересна и сама по себе, но меня больше волнует то, что V. cholerae – лишь один из многих видов бактерий, обладающих таким механизмом. Та же система секреции есть у десятков, а то и сотен видов в вашем пищеварительном тракте, и потому, изучив ее роль в кишечнике, мы могли бы лучше понять, от чего зависит структура вашего микробиома. Научившись манипулировать T6SS у разных бактерий, мы, возможно, проложили бы долгожданный путь к оздоравливающему перекраиванию кишечного микробиома.

Почти во всем, что мы наблюдали в кишке данио-рерио, проявлялся отчетливый биофизический след: физические аспекты поведения – плавание и навигация, формирование трехмерных колоний или манипуляция кишечными сокращениями – во многом определяли исходы. В другом эксперименте мы обнаружили, что под действием малых доз широко применяемого антибиотика обычно подвижные бактерии удлиняются и спутываются, а склонные к агрегации формируют более крупные кластеры, но в меньшем количестве. Оба сценария ведут к значительному общему сокращению бактериальной популяции, поскольку слишком уж сплоченные микробы выталкиваются усилиями кишечника. Вероятно, так и объясняются загадочные крупные изменения в кишечном микробиоме человека, запускаемые антибиотиком и выявляемые с помощью секвенирования. Но это-то и тревожит больше всего, ведь антибиотики в низких концентрациях – повсеместно распространенный загрязнитель. Этот проект, как и многие другие, мы выполняли вместе с лабораторией Карен Гиймен, а основное бремя экспериментов лежало на аспиранте-физике Брэндоне Шломанне и постдоке-биологе Трэвисе Уайлсе, с готовностью размывавших границы между науками.

Наблюдать за поведением бактерий прекрасно, но управлять ими, должно быть, еще лучше. И снова мы обращаемся к одной из наших красных нитей – к теме регуляторных цепей. В главе 4 мы познакомились с инструментами активации и инактивации отдельных генных цепей (вспомните мышей, меняющих цвет). Вышеупомянутый Трэвис Уайлс внедрил подобные переключатели в геном аборигенной кишечной бактерии данио-рерио и взял в свои руки контроль над ее плаванием и химической чувствительностью. Чтобы перемещаться в жидкости, эти бактерии вращают торчащим из одного конца клетки «хвостиком» – жгутиком наподобие штопора. Жгутик и его мотор строятся самосборкой множества разных белков, включая пару PomA и PomB в составе статора мотора (отмечены черным на рисунке основания жгутика). Без PomA и PomB нить жгутика формируется нормально, а вот мотор не создает крутящего момента, который вращал бы жгутик и за счет этого двигал клетку. Следовательно, переключатель, который под влиянием химического сигнала извне выключает гены pomA и pomB в бактерии, обычно экспрессирующей их, либо включает эти гены в бактерии, обычно их не задействующей, позволяет нам решать, будут ли модифицированные микробы плавать в кишечнике. (В нашем случае внешний сигнал должен быть постоянным, сродни кнопке, на которую надо непрерывно давить, чтобы свет не погас. Получается, положения этого переключателя не записываются в память – инженер назвал бы его переключателем мгновенного действия.)

Переключатель позволяет нам узнать больше, чем варианты с простым удалением или постоянной активацией генов. Так, если мы вырежем у бактерий гены, причастные к подвижности, и не найдем этих бактерий в кишечнике, то будем вынуждены выяснять: плавание – это способ удерживаться в кишечнике или прежде всего способ добираться до рыбы и колонизировать ее? Отключение тех или иных моделей поведения после колонизации позволяет нам обозначить роли изучаемых бактерий в специфических сценариях кишечной жизни. Отключение подвижности, как мы обнаружили, приводит к значительному сокращению популяции модифицированных микробов, поскольку они не в силах противостоять кишечным течениям, выносящим их из рыбы, и не могут размножаться так быстро, чтобы восполнять потери. Еще удивительнее, что само животное чувствует эти поведенческие нюансы. У данио-рерио, запрограммированных на производство зеленого флуоресцентного белка при каждой активации сети генов иммунитета, мы наблюдали мощный иммунный ответ на колонизацию рыбы нормальными, подвижными бактериями (как нам и подсказывали прежние наблюдения) и очень слабый ответ на заселение бактериями, неспособными плавать14. Разницу нельзя было объяснить связью иммунных клеток с поверхностными белками микробов, так как внешний вид бактерий не менялся. Мы заподозрили, что критична именно подвижность, поскольку она позволяет бактериям подбираться ближе к стенкам кишечника и контактировать с чувствительными клетками. Это еще нужно доказать, но в любом случае мы полагаем, что в смысле управления экосистемой поведение бактерий в кишечнике играет не меньшую роль, чем поведение животных в лесу.

Потенциал инженерии генетических схем волнует не только нас. Многие ученые уже поняли, что микробы могут «запоминать» условия в кишечнике и после прохождения по нему своим состоянием показывать, встречались ли у них на пути определенные токсины, питательные вещества и другие химические соединения15. В составе одной схемы с генными цепями, производящими особые биохимические агенты, генетические переключатели могли бы обеспечивать доставку лекарств только при должной стимуляции, используя способность клеток к принятию решений для замены традиционных таблеток более продвинутым лечением.