Чтение онлайн

Влияние цитоплазмы на ядро достигает такой степени, что оно определяет специфические типы синтеза мРНК. Де Робертис и Гёрдон (De Robertis и Gurdon) вводили ядра клеток шпорцевой лягушки (Xenopus), выращивавшихся в культуре ткани, в ооциты тритона Pleuradeles. Используя высокое разрешение с помощью двумерного гель-электрофореза, они могли отличать синтез белков, характерных для Xenopus, от белков, характерных для культивируемых клеток Pleurodeles, а также синтеза белков, характерных для культивируемых клеток Xenopus, от белков, характерных для ее ооцитов. При пересадке ядер из культивируемых клеток Xenopus в ооциты Pleurodeles в них начинали синтезироваться белки, свойственные ооцитам Xenopus, но не культивируемым клеткам. Эти изменения состава синтезируемых белков можно было предотвратить при помощи -аманитина - вещества, подавляющего синтез РНК. Таким образом, воздействие цитоплазматической среды ооцитов Pseudourodeles на ядра Xenopus заключалось в инактивации экспрессии одного набора генов и активации экспрессии другого набора, характерного для ооцитов.

Цитоплазма оказывает свое регулирующее действие на ядерную активность, скорее всего, на уровне транскрипции; известны случаи специфической транскрипции генов при дифференцировке. Один такой пример связан с кольцами Бальбиани в политенных хромосомах двукрылых. У мух и других двукрылых клетки некоторых тканей (слюнные железы, мальпигиевы сосуды, средняя кишка) содержат гигантские политенные хромосомы, в которых при окраске на ДНК выявляются четко выраженные поперечные полосы (диски). Показано, что многие отдельные полосы соответствуют местоположению отдельных генов и что можно установить корреляцию между генетической картой, с одной стороны, и характером и относительным физическим расположением полос, с другой. В некоторых дифференцированных клетках ограниченное число определенных полос образуют вздутия, выступающие за пределы хромосомы (пуфы). Особенно большие пуфы - кольца Бальбиани возникают в тех участках, в которых находятся гены, необычайно активные в отношении транскрипции. Кольца Бальбиани обладают четырьмя важными свойствами.

1. Клетки разного типа содержат разные кольца Бальбиани. Так, в слюнных железах двукрылого Acricotopus имеются клетки трех типов, которые все содержат одни и те же три гигантские хромосомы, но хромосомы из разных клеток различаются по характеру пуфов и их распределению.

2. Изменения, происходящие в клетках некоторых типов в процессе развития, коррелируют с изменениями в характере пуфов. У некоторых мух гигантские клетки подушечек на лапках в процессе развития претерпевают сложные изменения, сопровождающиеся упорядоченными последовательными изменениями пуфов политенных хромосом.

3. Кольца Бальбиани в политенных хромосомах служат местами активной транскрипции. Дэйнхолту (Daneholt) удалось изолировать единственную в своем роде высокомолекулярную РНК, транскрибированную в одном из колец Бальбиани мотыля Chironomus.

4. Существует прямая корреляция между наличием данного кольца Бальбиани и синтезом определенного белка. Гроссбах (Grossbach) изучал два близкородственных вида: Chironomus tentans и С. pallidivittatus, слюнные железы которых вырабатывают большие количества секреторных белков. В слюнных железах С. tentans синтезируется пять белков, а в железах С. pallidivittatus – те же пять белков и еще один. Синтез этого шестого белка коррелирует с наличием в 4-й хромосоме С. pallidivittatus определенного пуфа, отсутствующего у С. tentans. Скрещивая эти два вида и изучая полученные гибриды, Гроссбах показал, что синтез шестого белка у гибридов зависит от наличия у них 4-й хромосомы С. pallidivittatus с этим особым пуфом.

До недавнего времени такого рода данные рассматривали как доказательство того, что дифференциальная экспрессия генов в процессе развития обусловлена главным образом дифференциальной транскрипцией генов, как это ясно видно в случае колец Бальбиани. Однако некоторые недавние наблюдения заставили отнестись к этому заключению с некоторой осторожностью, поскольку может оказаться, что столь же важную роль играет регуляция экспрессии генов и на других уровнях.

Сложность или число различных уникальных последовательностей ДНК, представленных в виде РНК, обычно в 5-10 раз выше в ядерной РНК, чем в мРНК. Ядерные РНК, представляющие собой непосредственные продукты транскрипции, длиннее, чем мРНК, и содержат предшественники последних. Простая модель дифференциальной транскрипции требует, чтобы две стадии развития с сильно различающимися популяциями матричных РНК, подобные тем, которые изучал Галау, существенно различались и по своим ядерным РНК. Клин и Хамфри (Kleene, Humphreys) сравнивали ядерные РНК, имеющиеся у морского ежа на двух разных стадиях развития, и столкнулись с неожиданностью: число уникальных последовательностей ДНК, транскрибируемых в ядерные РНК, было очень велико (транскрибировалась примерно треть всех этих последовательностей), а последовательности ядерных РНК, присутствующие на этих двух стадиях, были идентичны. Такое сходство между ядерными РНК наблюдается на всех стадиях жизненного цикла. Уолд и др. (Wold et al.) отмечают, что лишь немногие из последовательностей мРНК, транслируемых в белки у зародышей морского ежа на стадии бластулы, присутствуют также в цитоплазме клеток взрослых особей, тогда как в ядрах эти же последовательности содержатся как у зародышей, так и у взрослых особей. Создается впечатление, что в ядрах на всех стадиях развития транскрибируется одно и то же очень большое число структурных генов, но что лишь определенные подмножества этих транскриптов подвергаются процессингу с образованием специфичных мРНК, транслируемых на каждой отдельной стадии.

Наличие транскрипционных, а также посттранскрипционных механизмов, регулирующих дифференциальную экспрессию генов, определяемую ядром, в конечном итоге затрудняет понимание факторов, регулирующих действие генов, однако существование этих механизмов не меняет вытекающий из всего нашего обсуждения основной эмбриологический вывод. Суть гипотезы, схематически изображенной на рис. 4-3, состоит в том, что определенные макромолекулы, локализованные в цитоплазме и распределенные по некоторым бластомерам зародыша, вызывают в этих бластомерах специфичную экспрессию генов, определяемую ядром.

Представляется вероятным, что локализованные цитоплазматические молекулы, модифицирующие экспрессию генов на ранних стадиях развития специфичным для каждого участка образом, отличаются разнообразием. Локализованные детерминанты встречаются у животных, относящихся ко многим типам, в том числе у гребневиков, немертин, кольчецов, моллюсков, членистоногих, иглокожих, оболочников и хордовых. В некоторых случаях действие локализованных детерминантов проявляется уже при первом делении яйца, как, например, в виде крупных полярных лопастей у ряда представителей Spiralia, в том числе у ничем другим непримечательной улитки Ilyanassa.

Последовательность событий, происходящих при первом митотическом делении оплодотворенного яйца Ilyanassa, показана на рис. 4-5. Вскоре после дробления на богатом желтком вегетативном полюсе яйца (расположенном против анимального полюса, на котором появляется борозда дробления) возникает выступающее наружу вздутие цитоплазмы, называемое полярной лопастью. Эта лопасть располагается перпендикулярно оси митотического веретена. Важно указать, что лопасть не содержит ядра и состоит только из цитоплазмы. Когда борозда дробления начинает углубляться, шейка, соединяющая лопасть с зародышем, быстро сжимается, превращаясь в тонкую нить цитоплазмы. По окончании делений дробления шейка полярной лопасти быстро увеличивается в диаметре и лопасть втягивается одним из бластомеров. Клетку, в которую включается лопасть, обозначают как бластомер CD, а другую клетку - как бластомер АВ.

Рис. 4-5. Появление и втягивание безъядерной лопасти при первом делении дробления у зародыша брюхоногого моллюска Ilyanassa (рисунок с натуры). В бластомерах АВ и CD имеются ядра, а богатая желтком полярная лопасть лишена ядра.

Полярную лопасть легко удалить, и зародыши, которые ее лишены, продолжают развиваться с такой же скоростью, как и нормальные зародыши. Однако из нормальных зародышей развивается сложная личинка, называемая велигером (парусником), у которой имеются разнообразные структуры, тогда как зародыши, лишенные полярной лопасти, образуют всего лишь комочек клеток, покрытый ресничками (рис. 4-6). Такой эффект возникает не просто в результате удаления некоторой части массы зародыша или сокращения поступления питательных веществ. Если поставить другой эксперимент - отделить на той же двуклеточной стадии бластомер АВ от бластомера CD, то из бластомера АВ, так же как из зародыша, лишенного полярной лопасти, не развивается полностью дифференцированный велигер. Однако из бластомера CD, обладающего примерно такой же массой, как лишенный лопасти зародыш, получается нормальный, хотя и маленький, велигер.

Рис. 4-6. Функция полярной лопасти в развитии. А. Нормальная личинка-велигер, имеющая глаза, ногу, раковину и внутренние органы. Б. Зародыш на той же стадии развития, у которого при первом дроблении была удалена полярная лопасть; никаких организованных структур у него нет. (Фотография любезно предоставлена Newrock.)

Возможно, что в полярной лопасти Ilyanassa заключены какие-то специфичные мРНК. Ньюрок и Рэфф (Newrock, Raff) установили, что у лишенных лопасти и у нормальных зародышей синтез белка даже на стадиях, предшествующих началу морфогенеза, протекает по-разному. Эти различия в синтезе белка наблюдались также между лишенными лопасти и нормальными зародышами при непрерывном выращивании их в присутствии таких количеств актиномицина, которые полностью подавляют синтез РНК. Эти результаты были интерпретированы как указание на то, что в полярной лопасти обособляются какие-то преформированные типы мРНК, потому что в зародышах, выращиваемых в присутствии актиномицина, происходит трансляция только тех мРНК, которые уже содержались в цитоплазме яйца ко времени формирования этой лопасти. Однако Брандхорст и Ньюрок (Brandhorst, Newrock), используя двумерный гель-электрофорез, позволяющий выявить несколько сот наиболее часто встречающихся видов белка, не обнаружили никаких качественных различий между белками нормальных зародышей и зародышей, лишенных полярной лопасти. Они, однако, обнаружили резко выраженные количественные различия, которые, возможно, и привели к результатам, полученным Ньюроком и Рэффом. Ни в той ни в другой работе не удалось выявить потенциально очень большое число редких видов мРНК, которые могли быть дифференциально обособлены в полярной лопасти.

Со сходной проблемой пришлось столкнуться при изучении зародышей морских ежей. При четвертом делении дробления у этих животных образуются клетки трех типов - мезомеры, макромеры и микромеры, значительно различающиеся по своим размерам. Клеткам этих трех типов уже в момент возникновения уготованы различные и вполне определенные судьбы. Роджерс и Гросс (Rodgers, Gross), а также Эрнст (Ernst) и ее сотрудники, используя метод гибридизации нуклеиновых кислот, обнаружили, что высокоповторяющаяся РНК распределена между этими тремя типами клеток неравномерно. Подобным же образом Мидзуно (Mizuno et al.) и Уайтли (Whiteley et al.) сообщают, что у разных бластомеров различны преобладающие транскрипты повторяющихся последовательностей ДНК. Картина осложняется наблюдением Туфаро и Брандхорста (Tufaro, Brandhorst) об отсутствии между бластомерами различий по характеру синтеза примерно 1000 видов белков, разделяемых методом двумерного гель-электрофореза. Локализованные последовательности, выявленные Роджерсом и Гроссом, а также Эрнст и ее сотрудниками, возможно, слишком редки, чтобы продуцировать достаточные количества белка, которые можно выявить методом двумерного гель-электрофореза, или это могут быть те последовательности, которые не входят в состав мРНК. Самые определенные доказательства того, что мРНК могут служить регуляторами морфогенеза, дает работа лаборатории Калтхофа (Kalthoff et al.) на яйцах двукрылого Smittia. У насекомых передний и задний концы яйца детерминируются во время оогенеза. В процессе нормального развития на переднем конце тела образуется голова и три грудных сегмента, а на заднем - ряд брюшных сегментов (и зачатковых клеток). В 1968 г. Калтхоф и Сандер сообщили, что облучение цитоплазмы на переднем конце яйца ультрафиолетом приводит к развитию зародыша, у которого вместо головы, груди и передних брюшных сегментов образуется как бы в зеркальном отображении второй задний конец тела. На рис. 4-7 изображены нормальный зародыш и урод с дуплицированным брюшком. Существуют две группы данных, указывающие на то, что развитие переднего конца тела детерминирует РНК. Одна группа данных получена в экспериментах с инактивацией РНК ультрафиолетом. В спектре действия ультрафиолета имеются пики при 265 и 285 нм, соответствующие максимальному эффекту; это позволяет считать, что ультрафиолет оказывает свое действие на комплекс нуклеиновая кислота-белок. Интересно отметить, что эффекты облучения ультрафиолетом обратимы; это достигается последующим воздействием на облученное яйцо света с длиной волны 320-480 нм. Ультрафиолет индуцирует в нуклеиновых кислотах образование пиримидиновых димеров и инактивирует эти молекулы. Обратимость этого эффекта под действием света происходит под влиянием фоточувствительного фермента, обусловливающего репарацию пиримидиновых димеров.