Чтение онлайн

Рис. 4-7. Нормальные зародыши и зародыши с двойным брюшком двукрылого Smittia. У нормального зародыша (А) видна слева развивающаяся голова, а справа-брюшные сегменты. У зародыша Б, которого облучали ультрафиолетом, голова отсутствует и на обоих концах тела развиваются брюшные сегменты (Kalthoff, 1969).

Вторая группа данных, указывающих на детерминирующую роль РНК в развитии переднего конца тела зародыша, получена в результате непосредственного воздействия специфических ферментов на цитоплазму переднего конца зародыша. Кандлер-Зингер (Kandler-Singer) и Калтхоф погружали зародыши в среду, содержащую исследуемый фермент, и затем прокалывали их в определенных местах. Образование дуплицированного брюшка происходило лишь в тех случаях, когда в передний конец яйца проникала активная РНКаза. Если использовалась неактивная РНКаза или если она проникала не в передний конец яйца, а в другие его участки, то дуплицированное брюшко получалось лишь в очень немногих случаях.

Есть и другие более косвенные данные о том, что РНК играет роль детерминанта и у других организмов. Образование зародышевых клеток на заднем конце яиц насекомых (и многих других организмов) зависит от детерминантов, называемых полярными гранулами, которые легко наблюдать в микроскоп. В ряде интересных экспериментов Илмензе и Маховалд (Ilmensee, Mahowald) вводили цитоплазму из заднего конца яйца дрозофилы одной генетически меченной линии в передний конец яйца другой генетически меченной линии. При этом на переднем конце яйца формировались зародышевые клетки. Полярные гранулы, подобно детерминантам переднего конца тела, чувствительны к облучению ультрафиолетом и, судя по реакции на цитологические красигели, содержат большое количество РНК. Домен и Вердонк (Dohmen, Verdonk) обнаружили в полярных лопастях зародышей некоторых брюхоногих моллюсков структуры, аналогичные полярным гранулам. Эти структуры, которые, как было установлено при помощи специфичных красителей, богаты РНК, по-видимому, содержат детерминанты, специфичные для полярных лопастей. Было бы заманчиво попытаться установить связь между этими структурами и очевидным обособлением мРНК в полярных лопастях, которое наблюдали Ньюрок и Рэфф, но достаточных оснований для этого у нас нет.

Возможно, из-за того что в настоящее время все внимание молекулярной биологии сосредоточено на нуклеиновых кислотах, экспериментальным изучением белков как локализованных детерминантов ядерной активности занимаются мало. А между тем такие белковые молекулы почти несомненно существуют. Так, у аксолотля имеется мутация, при которой отсутствие одного определенного белка оказывает резко выраженное воздействие на развитие. Эта мутация, обозначаемая буквой о (oocyte deficient), приводит к тому, что яйца, отложенные самками, гомозиготными по мутантному аллелю о, прекращают дробление и гибнут примерно в то время, когда нормальные зародыши проходят гаструляцию. Мутация о– классическая мутация с материнским эффектом, т. е. развитие потомков зависит только от генотипа матери (см. гл. 7). Таким образом яйца, отложенные самкой, гомозиготной по аллелю о (о/о), не развиваются даже при оплодотворении нормальной спермой. В отличие от этого все яйца гетерозиготной самки (о/ + ), даже та их половина, которая несет аллель о, развиваются нормально. Поскольку генотип самца не играет роли, самок, имеющих генотип о/о, можно получить, оплодотворяя яйца гетерозиготных самок спермой самцов, несущих аллель о. Бриггс и Кассенс (Briggs, Cassens) обнаружили, что неспособность к развитию яиц, отложенных самками о/о, можно преодолеть, если вскоре после оплодотворения ввести в них цитоплазму нормальных яиц. Результаты, полученные Бриггсом и Джастусом (Justus), показывают, что корректирующий фактор, отсутствующий в неполноценных яйцах, представляет собой белок.

В ряде исследований, в которых в яйца вводили белки, было твердо установлено, что некоторые белки легко проникают в ядра. Такие белки могут оказывать влияние на поведение ядра, как это обнаружили Бенбау и Форд (Benbow, Ford), которым удалось индуцировать синтез ДНК в ядрах, обрабатывая изолированные ядра лягушек белком, выделенным из цитоплазмы яиц и зародышей.

Во время оогенеза происходит чрезвычайно активная транскрипция генов и накопление ооцитами мРНК. Накапливающиеся в ооцитах мРНК столь разнообразны по своим последовательностям, что, как только после начала развития зародыша мРНК приступают к синтезу белков, с этих матриц могут транслироваться буквально тысячи видов различных белков. В наиболее хорошо изученном случае - у морского ежа - белковый синтез протекает очень вяло в неоплодотворенном яйце, но резко возрастает через несколько минут после оплодотворения. Это начальное усиление белкового синтеза (в сущности, весь белковый синтез), во всяком случае до наступления стадии бластулы, обеспечивает мРНК, синтезируемая во время оогенеза. Как корректирующий белок, устраняющий воздействие аллеля о у аксолотля, так и полярная плазма дрозофилы, обсуждавшаяся выше, обнаружены уже в ооцитах. Бриггс (Briggs) установил, что корректирующий белок синтезируется во время оогенеза и что его можно обнаружить в активной форме в самом начале этого процесса. Илмензе и его сотрудники предприняли поиски активной полярной плазмы в ооцитах дрозофилы. При помощи электронного микроскопа они сумели идентифицировать полярные гранулы на заднем полюсе ооцита в середине процесса вителлогенеза, т. е. во время максимального накопления желтка, но функциональную полярную плазму удается выявить лишь на поздних стадиях созревания ооцитов. Поэтому Илмензе и его сотрудники высказали мнение, что, хотя полярные гранулы, появляющиеся во время вителлогенеза, морфологически сходны с полярными гранулами яиц, они представляют собой, возможно, матрикс, к которому затем прикрепляются функциональные компоненты. Наконец, Домен и Вердонк (Dohmen, Verdonk) выявили на такой ранней стадии оогенеза, как вителлогенез, богатые РНК структуры, сходные с теми, которые позднее появляются в полярных лопастях брюхоногих моллюсков.

Таким образом, почти несомненно, что в яйцах детерминанты накапливаются во время оогенеза. Однако вопрос о том, когда эти материалы локализуются там, где им предстоит функционировать, остается открытым. В модели локализации, изображенной на рис. 4-3, сделано упрощающее допущение, что характер локализации уже установлен в яйце еще до того, как начинается дробление. В некоторых случаях это действительно так, но в других изменения локализации продолжаются и, возможно, завершаются лишь после того, как дробление зашло уже достаточно далеко.

Классическим примером событий, связанных с цитоплазматической локализацией, которые инициируются оплодотворением, служит перемещение пигментных гранул у асцидий Cynthia (Styela) partita, описанное Конклином (Conklin) в 1905 г. Последовательные перемещения цитоплазмы, происходящие после оплодотворения, показаны на рис. 4-8, взятом из этой статьи. Неоплодотворенное яйцо имеет равномерную сероватую окраску, но почти сразу же после проникновения в него сперматозоида начинается быстрая реорганизация цитоплазмы. Наиболее впечатляющее изменение - это быстрое перетекание желтых гранул к вегетативному полюсу яйца. Затем этот желтый материал постепенно распространяется в стороны от вегетативного полюса, пока не покроет все вегетативное полушарие. При перемещении ядра сперматозоида к одной стороне вегетативного конца за ним увлекается значительная часть желтого материала, из которого образуется желтый серп. Локализация желтого серпа, определяемая перемещением ядра сперматозоида и связанной с ним звезды, обозначает местоположение заднего конца развивающегося зародыша. Другие материалы цитоплазмы также занимают определенное место, так что ко времени первого дробления яйцо содержит четко выраженный желтый серп (3), темно-серый желток (4) и участки прозрачной цитоплазмы (5), а также три менее четко различимых окрашенных участка. Локализация всех этих веществ указывает на то, что судьбы участков, в которых они содержатся, предопределены; так, из материала желтого серпа образуются только мышечные клетки головастикоподобной личинки, темно-серый материал дает энтодерму, а прозрачная цитоплазма - эктодерму. Это, конечно, не означает, что детерминантами являются сами окрашенные материалы: просто они служат хорошо различимыми индикаторами перемещений цитоплазмы, определяющих локализацию детерминантов.

Рис. 4-8. Становление цитоплазматической локализации у зародыша асцидии Styela partita (Conklin, 1905). А. Яйцо с еще интактным зародышевым пузырьком (1). Б. Разрушение зародышевого пузырька и перемещение цитоплазмы. В и Г. Зародыш на стадии двух бластомеров (в двух разных ракурсах) с хорошо выраженным желтым серпом. Д. Стадия 8 бластомеров. Е. Ранняя личинка, у которой материал желтого серпа сосредоточен вокруг мышечных клеток хвоста (6).

1-зародышевый пузырек; 2-желточные гранулы; 3-желтый серп; 4-желток; 5-прозрачная цитоплазма; 6-мышечные клетки; 7-нервная пластинка.

У ряда организмов становление локализации происходит лишь после того, как дробление достаточно продвинулось. Изучение зародыша гребневика Mnemiopsis, проведенное Фриманом (Freeman), дало один из наиболее хорошо документированных примеров этого явления. Гребневики составляют небольшую группу прозрачных животных, несколько сходных по виду с медузами. Они обладают двулучевой симметрией и обычно снабжены восемью рядами гребных пластинок; каждая пластинка состоит из длинных слившихся между собой ресничек, при помощи которых гребневики плавают. Если потревожить животное, то можно наблюдать волнообразные вспышки зеленоватого света, испускаемого особыми клетками-фотоцитами, находящимися в меридиональных каналах, которые расположены под рядами гребных пластинок. Как ресничные клетки гребных пластинок, так и фотоциты уже имеются на личиночной стадии, и дифференциация как тех, так и других обусловлена действием локализованных детерминантов зародыша.

Развитие Mnemiopsis происходит по мозаичному типу. Если отделить друг от друга бластомеры двуклеточного зародыша, то из каждого бластомера разовьется неполный зародыш, содержащий структуры одной из сагиттальных половинок нормального зародыша. При разделении бластомеров 4-клеточного зародыша образуются четвертушки нормального зародыша, содержащие покрытые ресничками гребные пластинки и фотоциты. Восьмиклеточные зародыши состоят из бластомеров двух типов: четырех клеток E и четырех клеток М. Если отделить их друг от друга и дать им возможность развиваться, то из клеток E образуются неполные зародыши, содержащие покрытые ресничками гребные пластинки, но лишенные фотоцитов, а из клеток M - неполные зародыши, содержащие фотоциты, но лишенные гребных пластинок. При следующем делении, в результате которого получается 16-клеточный зародыш, бластомеры E и бластомеры M делятся неравномерно. Из каждого бластомера E получается один макромер (клетка Е) и один микромер (клетка е); каждый бластомер M аналогичным образом дает макромер M и микромер m. Цитоплазматические детерминанты распределяются между этими клетками таким образом, что после дальнейшего развития наблюдается следующая картина дифференцировки:

Микромеры е — ресничные гребные пластинки

Макромеры Е — ресничных гребных пластинок нет

Микромеры m — фотоцитов нет

Макромеры M — фотоциты

Фримен проделал ряд микрургических экспериментов, чтобы выяснить, на какой стадии дробления устанавливается характер локализации детерминантов. С этой целью он нанес на карту те участки бластомеров 2- и 4-клеточного зародыша, из которых на 8-клеточной стадии должны образоваться клетки Е и М. Если локализация детерминантов наступает на ранних стадиях дробления, как это показано на рис. 4-3, то удаление цитоплазмы из участка Е или из участка М бластомера 2-клеточного зародыша должно приводить к таким же результатам, как и удаление всех бластомеров Е или всех бластомеров М на 8-клеточной стадии. Иными словами, удаление Е-участка цитоплазмы из бластомера 2-клеточного зародыша приведет к тому, что клетки, образующиеся в процессе дальнейшего развития этого бластомера, утратят способность к формированию ресничных гребных пластинок, тогда как удаление М-участка приведет соответственно к утрате способности к формированию фотоцитов. В действительности, как установил Фримен, это предсказание не подтверждается. Локализация этих двух потенций в бластомерах едва намечается на 2-клеточной стадии, но почти полностью выражена у 4-клеточного зародыша; из этого следует, что, хотя цитоплазматические материалы, детерминирующие дифференцировку гребных пластинок и фотоцитов, уже присутствуют в яйце в начале дробления, они окончательно локализуются лишь к третьему дроблению.

Сроки локализации детерминантов у дробящихся зародышей подвержены регуляции. Работы Фримена и Герье (Freeman, Guerrier), а также Дэна и Икеда (Dan, Ikeda) и других авторов показывают, что события, связанные с локализацией и ранней детерминацией морфогенеза, сопряжены с регуляцией сроков митотических делений дробления - с так называемыми часами дробления. Эти часы представляют собой мало изученный механизм, при помощи которого зародыш отсчитывает в реальном времени число проделанных циклов дробления и определяет параметры следующего дробления. Существование этих часов было продемонстрировано в экспериментах, в которых одно из ранних делений дробления подавляли, а затем дроблению давали возможность возобновиться. Так, например, у зародышей морского ежа четвертое деление дробления бывает неравномерным, приводя к образованию как микромеров, так и более крупных бластомеров. Если подавить один из ранних циклов деления, а затем допустить дальнейшее дробление, то последующие деления происходят в ладлежащие сроки, несмотря на то что они запаздывают на один цикл. Таким образом, в срок, соответствующий четвертому дроблению нормального зародыша, экспериментальный зародыш образует только 8 клеток вместо 16. Важно отметить, что, хотя экспериментальный зародыш образует только 8 клеток, дробление у него происходит неравномерно, как и у нормального зародыша в эти сроки, и образуются микромеры. Стало быть, сроки наступления неравномерного дробления, при котором возникают микромеры, регулируются внутренними часами, отсчитывающими абсолютное время, а не числом фактически предшествовавших ему циклов дробления. Начало хода часов, по-видимому, сцеплено с формированием звезды. У некоторых зародышей часы приводятся в действие при завершении мейоза, у других - при инициации первого деления дробления.