Чтение онлайн

Фракции гемоглобина

Существуют физиологические и патологические виды гемоглобина. К физиологическим относят три основных типа гемоглобина: примитивный – Р; фетальный – F; взрослый – А.

Помимо физиологических, выделено более 200 форм патологических гемоглобинов, отличающихся друг от друга физико-химическими свойствами, в частности различной электрофоретической подвижностью и разным отношением к щелочам. Среди гемоглобинопатий наиболее известна гемоглобинопатия S – серповидно-клеточная анемия.

Одним из наиболее широко распространенных методов, позволяющих выявить патологические гемоглобины, является электрофоретический метод исследования. Исследование патологических гемоглобинов является трудоемким и проводится в специализированных лабораториях.

Эритроциты

Эритроциты – наиболее многочисленная популяция клеток.

В кровеносном русле при нормальных физиологических условиях эритроцит имеет форму двояковогнутого диска. Сухое вещество эритроцита содержит около 95 % гемоглобина, остальные 5 % приходятся на долю других белков, липидов, ферментов. Основная функция эритроцитов – снабжение тканей кислородом и транспорт углекислого газа. Они участвуют в поддержании буферного ионно-водного равновесия, взаимодействуют с циркулирующими иммунными комплексами за счет Fс-рецепторов клеточной мембраны, обладают антигенными свойствами. Продолжительность жизни эритроцитов – 100–120 дней, разрушаются они макрофагами селезенки.

Подсчет эритроцитов в крови осуществляется двумя методами – в счетной камере и гематологическом анализаторе.

Унифицированный метод подсчета в счетной камере

Принцип

Подсчет эритроцитов под микроскопом в определенном количестве квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мкл крови, исходя из объема квадратов и разведения крови.

Реактивы

0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

Специальное оборудование

Счетная камера Горяева.

Микроскоп.

Ход исследования

Исследуемую кровь разводят в 200 раз. Для этого в сухую пробирку отмеривают 4 мл реактива 1. Пипеткой набирают 20 мкл крови. Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей и кровь выдувают на дно пробирки с реактивом 1, пипетку тщательно промывают в верхнем слое жидкости, повторно набирая ее и выдувая в пробирку, содержимое пробирки перемешивают и оставляют стоять до момента счета (рекомендуется считать эритроциты в течение ближайших 2–3 ч после взятия крови, а при гемолитических и В12-дефицитной анемии – сразу после взятия, так как эритроциты могут разрушиться).

Подготавливают счетную камеру: протирают насухо камеру с сеткой и покровное стекло, затем покровное стекло притирают к камере, слегка надавливая на него таким образом, чтобы по краям его появились радужные полосы (это свидетельствует о требуемой высоте камеры – 0,1 мм).

Заполняют счетную камеру разведенной кровью: предварительно несколько раз тщательно встряхивают содержимое пробирки, затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы она равномерно, без пузырьков воздуха, заполнила всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в бороздки. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания эритроцитов).

Для подсчета эритроцитов, не меняя горизонтального положения камеры, помещают ее на столик микроскопа и с помощью малого увеличения микроскопа (объектив 8х, окуляр 10х) находят верхний левый край сетки (для лучшего контрастирования следует опустить конденсор и прикрыть диафрагму). Счет производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах сетки, расположенных по диагонали. Для того чтобы одни и те же эритроциты, лежащие на линиях, не попали дважды в счет, принято для каждого квадрата, кроме элементов, лежащих внутри квадрата, считать расположенные на определенных двух линиях (например, на левой и верхней).

Расчет количества эритроцитов

Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят исходя из разведения крови (200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата (1/4000 мкл) по следующей формуле:

X = (а х 4000 х 200) / 200,

где Х – число эритроцитов в 1 мкл крови;

а – число сосчитанных эритроцитов.

В результате сокращения Х = а х 10 000.

Причины ошибок при подсчете эритроцитов:

1) неточность при взятии крови в пипетку;

2) неудовлетворительная градуировка пипеток;

3) образование сгустка крови;

4) неправильное притирание покровного стекла камеры или недостаточная его толщина (менее 0,3 мм);

5) подсчет производят сразу после заполнения камеры, когда клетки еще не успели осесть на дно;

6) плохо вымытые и недостаточно высушенные пипетки и пробирки;

7) недоброкачественность реактивов, вызывающих гемолиз;

8) любое отклонение от правил подготовки камеры, ее заполнения и подсчета клеток.

Метод автоматического подсчета эритроцитов с помощью счетчиков и гематологических анализаторов облегчает выполнение этого исследования и делает его более производительным.

Унифицированная методика автоматического подсчета эритроцитов

При работе с гематологическими счетчиками подготовка пробы (разведение) осуществляется вручную. При использовании гематологических анализаторов отбор пробы крови и ее обработка происходят без участия лаборанта.

Принципы работы

Принцип работы большинства анализаторов основан на кондуктометрическом методе: определенное количество разведенной изотоническим раствором натрия хлорида или другого электролита крови пропускается через микроотверстие, проходящая через него клетка увеличивает сопротивление между электродами, и возникающий импульс передается на счетное устройство с цифровой индикацией.

Ход исследования

Ход исследования выполняется в соответствии с инструкцией, прилагаемой к анализатору.

Нормальные величины

Количество эритроцитов в крови здорового человека составляет, по данным А. И. Воробьева, у мужчин – 4,0–5,1 Т/л, у женщин – 3,7–4,7Т/л.

Клиническое значение

Снижение количества эритроцитов (эритроцитопения) является одним из основных критериев анемического синдрома. От истинный анемии необходимо отличать гидремию, связанную с увеличением объема плазмы за счет притока тканевой жидкости. Причинами анемии являются кровопотери, нарушения кроветворения в костном мозге и повышенный гемолиз. Кроме того, уменьшение количества эритроцитов имеет место при лейкозах, множественной миеломе, неходжкинских лимфомах, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, метастазах злокачественных опухолей и др. Уменьшение количества эритроцитов наблюдается также при недостаточном содержании белка в пище, голодании, вегетарианской диете.

Увеличение количества эритроцитов в единице объема крови называется полиглобулией или эритроцитозом. Причины эритроцитозов представлены в таблице 20.

Таблица 20. Увеличение количества эритроцитов в единице объема крови

В клинической практике морфологию эритроцитов обычно исследуют в окрашенных мазках крови.

Окраска эритроцитов

Эритроциты окрашиваются кислыми красителями в розовато-красный цвет. Степень оксифилии клетки обусловлена присутствием гемоглобина и его количеством. Эритроциты здоровых людей имеют равномерную окраску и небольшое просветление в центре (нормохромия). Бледная окраска эритроцитов с широкой неокрашенной центральной частью называется гипохромией. Гипохромия эритроцитов обусловлена низким содержанием гемоглобина в эритроцитах и чаще характерна для дефицита железа, но также имеет место при свинцовом отравлении, талассемии. Гипохромия обычно сочетается с микроцитозом.

Выделяют три степени гипохромии:

– 1 (+) – просветление в центре несколько больше нормы;

– 2 (++) – окрашенная часть представлена в виде узкой ленты;

– 3 (+++) – окрашенная часть представлена в виде очень узкого кольца.

Усиленная окраска эритроцитов называется гиперхромией, обусловлена увеличением объема эритроцитов и обычно сочетается с макрои мегалоцитозом.

Анизохромия – различная интенсивность окрашивания отдельных эритроцитов или участков одного эритроцита, часто встречается при железодефицитной анемии.

Полихроматофилия – недостаточное накопление гемоглобина в эритроцитах с остатками базофильной субстанции. Незрелый эритроцит воспринимает и кислую, и щелочную краску и окрашивается в цвет от синего до серовато-розового. В норме встречаются единичные полихроматофильные эритроциты. Число их может увеличиваться при усиленном эритропоэзе постгеморрагические, гемолитические анемии.

Выделяют три степени полихромазии:

1) Р1+ – единичные полихроматофилы через каждые 2–3 поля зрения;

2) Р2++ – 1–4 полихроматофила в каждом поле зрения;

3) Р3+++ – более 10 полихлорматофилов в каждом поле зрения.

При морфологическом исследовании эритроцитов необходимо определить наличие в мазке патологических форм эритроцитов или включений в эритроцитах. Эритроциты с ядром – нормобласты, эритробласты – встречаются при самых разнообразных состояниях. Наиболее высокая степень содержания нормобластов имеет место при гемолитической анемии в момент гемолитического криза, при хроническом миелофиброзе, метастазах злокачественных опухолей в костный мозг.

Включения

При В12-дефицитной анемии и после спленэктомии встречаются эритроциты с остатками ядер в виде колец Кебота, телец Жолли, пылинок Вейденрейха.

Тельца Жолли – остатки ядерного хроматина округлой формы размером 1 мкм и более в количестве от 1 до 3 в эритроците, красно-фиолетового цвета. Кольца Кебота – остатки ядерной оболочки в виде тонких, нитеобразных колечек, окрашенных в красный цвет.

Пылинки Вейденрейха – остатки ядерного вещества розового, иногда голубого цвета, встречаются при тяжелых анемиях, главным образом – мегалобластных. Тельца Гейнца – Эрлиха представляют собой обычно одно круглое включение (реже 2–3) размером 1–2 мкм, располагающееся по периферии эритроцита. При обычной окраске по Романовскому они не видны. Определяют их по методике Дейге с метиловым фиолетовым. Тельца при этом окрашиваются в пурпурно-красный цвет. Появление телец Гейнца – Эрлиха является доказательством тяжелого токсического повреждения веществами, окисляющими гемоглобин (нитробензол, анилин, нитроглицерин, сульфаниламидные препараты) и приводящими к гемолизу.

Эритроцитометрия (измерение диаметра эритроцитов)

Унифицированная микроскопическая методика измерения диаметра эритроцитов с помощью окуляр-микрометра в окрашенном мазке крови.

Клиническое значение

Сдвиг эритроцитометрической кривой влево чаще имеет место при железодефицитных анемиях, микросфероцитозе, талассемии, свинцовом отравлении. Сдвиг эритроцитометрической кривой вправо наблюдается при B12– и фолиеводефицитной анемиях, алкоголизме, диффузных поражениях печени.

Общий объем эритроцитов (гематокритная величина) Гематокритная величина, или показатель гематокрита, дает представление о соотношении между объемами плазмы и форменных элементов крови (главным образом – эритроцитов), полученном после центрифугирования крови. Принято гематокритной величиной выражать объем эритроцитов.

Метод определения гематокрита с помощью микроцентрифуг

Нормальные величины

У здоровых людей гематокрит венозной и капиллярной крови равен:

1) для мужчин – 40–48 % (или 0,4–0,48);

2) для женщин – 36–42 % (или 0,36-0,42);

3) у детей:

а) 0,5 месяца – 41–65 %;

б) 1 месяц – 33–55 %;

в) 2 месяца – 26–42 %;

г) 4 месяца – 32–44 %;

д) 6 месяцев – 31–41 %;

е) 9 месяцев – 32–40 %;

ж) 12 месяцев – 33–41 %.

Клиническое значение

Снижение гематокрита характерно для анемий (до 20–25 %), по его величине можно судить о степени анемии. Существенное увеличение (до 65 %) наблюдается при полицитемии, менее значительное (50–55 %) – при симптоматических эритроцитозах, сопутствующих порокам сердца, легочной недостаточности, некоторых гемоглобинопатиях. Величина гематокрита характеризует степень гемоконцентрации и гемодилюции. Используют значения гематокрита для расчетных показателей, характеризующих эритроциты: средний объем, средняя концентрация гемоглобина, а также для ряда биохимических показателей.

Определение гематокрита на гематологических анализаторах входит в программу. Обычно используют либо кондуктометрический, либо микроцентрифужный метод. В некоторых анализаторах гематокрит определяется расчетным путем, исходя из количества эритроцитов в определенном объеме крови (например, 1 мкл) и среднего объема одного эритроцита. Ход определения осуществляется в соответствии с инструкцией, прилагаемой к прибору.

Индексы эритроцитов В клинической практике используют различные расчетные характеристики, отражающие физико-химические свойства эритроцитов. Наиболее широко применяют расчет цветового показателя.

Цветовой показатель

Индекс отражает относительное содержание гемоглобина в эритроцитах. Вычисляют цветовой показатель определением отношения двух частных, полученных от деления количества гемоглобина на количество эритроцитов в норме и в исследуемой крови по следующей формуле:

где Хгем – найденное количество гемоглобина;

Nгем – нормальное количество гемоглобина;

Хэр – найденное количество эритроцитов;

Nэр – нормальное количество эритроцитов.

Если принять, что в норме в 100 мл крови содержится 16,7 г гемоглобина и 5 млн эритроцитов в 1 мкл крови, то рассчитывают по формуле:

при сокращении:

В практической работе удобно пользоваться для подсчета цветового показателя пересчетными таблицами, а также номограммами.

Нормальные величины

У здоровых людей цветовой показатель находится в пределах 0,86-1,05.

Клиническое значение

По величине цветового показателя принято делить анемии на гипохромные, нормохромные и гиперхромные. Гипохромные анемии широко распространены (с цветовым показателем ниже 0,86) и наблюдаются прежде всего при дефиците железа, вызванном различными причинами. Особенно выраженной гипохромией (0,6–0,5 и ниже) характеризуются железодефицитные анемии, обусловленные хроническими кровопотерями.

Менее выраженная гипохромия эритроцитов (0,7–0,8) наблюдается при железодефицитной анемии беременных, при инфекциях, опухолях. Редко встречаются гипохромные анемии, не связанные с дефицитом железа и обусловленные нарушением синтеза гемоглобина в результате свинцового отравления или наследственного повреждения синтеза порфиринов и цепей глобина (бета-талассемии, альфа-талассемии и др.). Повышение цветового показателя – гиперхромия – является характерным лабораторным признаком различных В12-дефицитных и фолиеводефицитных анемий.

Особенно выражена гиперхромия эритроцитов (1,2–1,3) при рецидиве анемии Аддисона – Бирмера. Нормохромные анемии наблюдаются при некоторых гемолитических формах малокровия, острых кровопотерях, лейкозах, сопутствуют циррозу печени.

Среднее содержание гемоглобина в эритроците

Показатель отражает абсолютное содержание гемоглобина в одном эритроците в пикограммах (ПГ). Определяют путем деления концентрации гемоглобина на число эритроцитов.

где МСН – Mean Corpuscular Haemoglobin.

Поскольку 1 г = 1012 ПГ, то формула после сокращения на 1012 принимает вид:

Кроме того, расчет данного показателя можно произвести по номограмме (по Мазону) или с помощью современных автоматических гематологических анализаторов.

Нормальные величины

Нормальные величины составляют 27–31 ПГ.

Клиническое значение

Показатель среднего содержания гемоглобина в эритроците важен для суждения о гипои гиперхромии эритроцитов. Снижение среднего содержания гемоглобина в эритроците (гипохромия) наблюдается вследствие уменьшения объема эритроцитов (микроциты) или понижения содержания гемоглобина в нормальном по объему эритроците. Таким образом, гипохромия не всегда сочетается с микроцитозом, а может быть и при нормои макроцитозе. Это истинный показатель дефицита железа в организме или железорефрактерности, т. е. неусвоения железа эритробластами и нарушения синтеза гема (сидеробластные анемии). Нормохромия обычно имеет место у здоровых людей, но может отмечаться и при некоторых анемиях (острых постгеморрагических, гемолитических, апластических). Гиперхромия зависит исключительно от толщины эритроцитов (макроциты, мегалоциты), а не от степени насыщения их гемоглобином. Это объясняется тем, что концентрация гемоглобина в эритроците имеет предельную величину, не превышающую 0,33 ПГ в 1 МКМ3 объема эритроцита. Гиперхромия с макроцитозом характерна для расстройства обмена витамина В12 или его дефицита (мегалобластные анемии), при некоторых гемолитических и миелотоксических анемиях, нарушениях функции печени.

Резистентность эритроцитов Для оценки физико-химических свойств эритроцитов исследуют их резистентность к различным воздействиям. Наиболее часто в клинике определяют осмотическую резистентность эритроцитов. Различают минимальную и максимальную резистентность. Минимальная резистентность эритроцитов определяется максимальной концентрацией гипотонического (менее 0,85 %) раствора хлорида натрия (в серии постепенно уменьшающихся концентраций), при которой начинается гемолиз наименее устойчивых эритроцитов, находящихся в растворе 3 ч. Максимальная резистентность эритроцитов определяется максимальной концентрацией гипотонического раствора хлорида натрия, вызывающего в течение 3 ч гемолиз всех эритроцитов.

Унифицированная методика определения осмотической резистентности эритроцитов в модификации Л. И. Идельсона

Принцип

Количественное определение степени гемолиза эритроцитов в забуференных гипотонических растворах хлорида натрия.

Нормальные величины

У здоровых людей в свежей крови гемолиз (минимальная резистентность эритроцитов) начинается при концентрации хлорида натрия 0,50-0,45 %, а полный гемолиз (максимальная резистентность эритроцитов) наблюдается в 0,40-0,35 %-ном растворе хлорида натрия.

Клиническое значение

Исследование проводят при подозрении на гемолитическую анемию. Понижение осмотической резистентности, т. е. появление гемолиза эритроцитов при более высокой, чем в норме, концентрации хлорида натрия (0,70-0,75 %) наблюдается при наследственном микросфероцитозе и некоторых наследственных несфероцитарных гемолитических анемиях, а также иногда при аутоиммунной гемолитической анемии. В ряде случаев понижение осмотической резистентности характерно для талассемии, гемоглобинопатий, возможно при механической желтухе.

Пробы на ферментопатию эритроцитов В эритроцитах протекают различные метаболические процессы: гликолиз, пентозофосфатный путь окисления глюкозы, восстановление глутатиона, разрушение перекиси водорода и другие реакции метаболизма. Нарушения этих процессов могут быть связаны с наследственными дефектами синтеза ферментов (энзимопатии). Наиболее распространенной ферментопатией эритроцитов является нарушение синтеза глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) – ключевого фермента пентозофосфатного пути окисления глюкозы. Существует обратное соотношение между активностью Г-6-ФДГ и резистентностью эритроцитов, поэтому дефицит Г-6-ФДГ в клетке может приводить к гемолизу эритроцитов (гемолитический криз) при приеме пациентами ряда препаратов, действующих как оксиданты, – противомалярийных средств (примахин), ацетилсалициловой кислоты, сульфаниламидов, нитрофуранов, 5-НОК, ПАСК, фенацитина и др. Для диагностики дефицита Г-6-ФДГ применяются как качественные методики, так и количественные определения ее активности в эритроцитах.

Тест на образование телец Гейнца – Эрлиха

Нормальные величины

У здоровых людей в эритроцитах наблюдается образование единичных телец красного цвета. Небольшое количество телец Гейнца обнаруживают в клетках новорожденных или больных после спленэктомии.

Клиническое значение

В эритроцитах с дефицитом Г-6-ФДГ обнаруживается 4–6 телец. Проба неспецифична, поскольку тельца Гейнца появляются в эритроцитах при передозировке сульфаниламидных препаратов, отравлениях анилиновыми красителями, дефиците других ферментов (глутатион-редуктазы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы), у носителей нестабильных гемоглобинов.

Качественная методика Мотульского – Кемпбеля

Нормальные величины

У здоровых людей смесь обесцвечивается через 40–55 мин.

Клиническое значение

Замедление времени обесцвечивания смеси более 90 мин свидетельствует о дефиците в эритроцитах Г-6-ФДГ. При гемолитической энзимодефицитной анемии обесцвечивание наступает через 3-24 ч.

Качественная методика по Бернштейну

Нормальные величины

У здоровых людей обесцвечивание смеси происходит через 15–20 мин.

Клиническое значение

Удлинение времени обесцвечивания свидетельствует о дефиците в эритроцитах Г-6-ФДГ. Неполное обесцвечивание за 30 мин соответствует незначительному уменьшению активности фермента, а отсутствие обесцвечивания к этому времени – резкому ее снижению.

Цитохимические исследования эритроцитов

Цитохимические методы исследования основаны на химических реакциях, позволяющих обнаружить в клетках полисахариды, липиды, нуклеиновые кислоты, ферменты и другие соединения. Цитохимические исследования обычно отличаются простотой, не требуют специального оборудования и дают ориентировочное представление о количестве определяемого вещества. При цитохимическом исследовании чаще всего пользуются полуколичественной оценкой результатов, основанной на степени интенсивности специфической окраски.

В зависимости от нее делят все элементы на 4 степени:

1) отрицательные, т. е. неокрашенные (—);

2) слабо положительные (+);

3) положительные (++);

4) резко положительные (+++).

Цитохимические исследования эритроцитов проводят с целью выявления различных внутриклеточных включений, наличия разных форм гемоглобина, ферментных нарушений.