Чтение онлайн

Определение негемоглобинового железа

Сидероциты и сидеробласты – это эритроциты и эритробласты (нормобласты), содержащие в цитоплазме негемоглобиновое железо в виде гемосидерина и ферритина.

Нормальные величины

В периферической крови число сидероцитов не превышает 1,1 % и составляет в среднем 0,6 ± 0,04 %; в костном мозге их несколько больше – 0,2–2,1 %; количество сидеробластов (ядерных эритроцитов с железосодержащими гранулами) в костном мозге – 23,7 ± 2,4 %.

Клиническое значение

Снижение сидероцитов и сидеробластов характерно для железо дефицитных анемий. Повышение железосодержащих клеток наблюдается при гемолитических анемиях, после спленэктомий, при миелодиспластическом синдроме (рефрактерной сидеробластной анемии), эритромиелозе.

Методика определения фетального гемоглобина по Бетке

Нормальные величины

У взрослых встречаются единичные окрашенные эритроциты (содержащие гемоглобин F); увеличение числа окрашенных эритроцитов наблюдается у новорожденных и детей до 5-месячного возраста.

Клиническое значение

Увеличение числа эритроцитов с HbF наблюдается у больных гомозиготной талассемией (до 5 %), серповидноклеточной анемией (1-30 %). До 10 % HbF можно обнаружить при пароксизмальной ночной гемоглобинурии, рефрактерной сидеробластной анемии, острых лейкозах, врожденном хроническом миелолейкозе. Снижение HbF наблюдается при гемолитической анемии новорожденных.

Активность Г-6-ФДГ (К.Ф.1.1.1.49)

Нормальные величины

В эритроцитах здоровых людей обнаруживают 10–20 гранул формазана.

Клиническое значение

Снижение числа гранул формазана в эритроцитах или их отсутствие указывает на дефицит Г-6-ФДГ. Прием противомалярийных препаратов, фенацетина, больших доз аскорбиновой кислоты, некоторых сульфаниламидов у таких больных может вызвать гемолитическую анемию. Случаи гемолиза возможны при отравлении бобами, диабетическом ацидозе.

Скорость оседания эритроцитов (Erytrocyte Sedimentation Rate)

Скоростью оседания эритроцитов (СОЭ) называется скорость разделения несвернувшейся крови на два слоя: нижний, состоящий из осевших эритроцитов, и верхний – из прозрачной плазмы.

Исследование СОЭ является одним из самых распространенных методов в лабораторной практике и входит в состав общего клинического анализа крови.

Унифицированная методика Панченкова

Принцип

Свойство крови, смешанной с цитратом натрия, не свертываться при стоянии, а разделяться на два слоя: нижний – эритроциты, верхний – плазма. Расслоение происходит с различной скоростью в зависимости от изменения химических и физических свойств крови. Скорость оседания измеряется в 1 мм за 1 ч.

Нормальные величины

У здоровых мужчин 1-10 мм/ч, у женщин 2-15 мм/ч. У детей на протяжении 1 года жизни СОЭ колеблется между 5,0 + 2,0 мм/ч и 8,0 + 3,0 м/ч, в дальнейшем – между 7,0 + 3,0 м/ч и 9,0 + 3,0 м/ч.

Примечание. При температуре воздуха в помещении, где проводится исследование, ниже 20 °C СОЭ замедляется, выше 20 °C – увеличивается.

Ошибки при постановке СОЭ:

1) нарушение соотношения крови и цитрата;

2) неполное заполнение капилляра;

3) неправильная постановка капилляра;

4) некачественный раствор цитрата натрия;

5) постановка СОЭ позже 2 ч после взятия крови;

6) отклонение температуры;

7) образование сгустка;

8) грязный капилляр;

9) неоткалиброванные капилляры.

Клиническое значение

Одной из основных причин увеличения СОЭ является изменение соотношения между белковыми фракциями крови в сторону увеличения доли крупнодисперсных белков. Играет роль и соотношение между холестерином и лецитином. Уменьшение количества эритроцитов также ведет к увеличению СОЭ. Наиболее частой причиной увеличения СОЭ являются воспалительные заболевания самой различной этиологии (пневмония, сепсис, холецистит), острые и хронические инфекции (туберкулез, инфекционный мононуклеоз, краснуха), инфаркт миокарда, анемии, оперативные вмешательства, беременность, гипопротеинемии. Особенно значительные величины СОЭ отмечены при парапротеинемических гемобластозах (до 60–80 м/ч) и и симптоматических парапротеинемиях, сопутствующих злокачественным новообразованиям (особенно при распаде опухоли), хроническому активному гепатиту, циррозу печени, системным заболеваниям соединительной ткани. Замедление СОЭ наблюдается при истинной полицитемии, гиперпротеинемии, механической желтухе, вирусном гепатите и симптоматических эритроцитозах.

Ретикулоциты

Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. При нормальном эритропоэзе ретикулоциты в основном созревают в костном мозге в течение 2–3 дней, 24 ч они находятся в кровеносном русле и превращаются там в зрелые эритроциты. Если ретикулоциты попадают в кровь несозревшими, то время циркуляции увеличивается до 3 суток. Ретикулоциты являются отражением эритропоэтической активности костного мозга, высвобождения из костного мозга большого числа юных клеток.

Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей собой агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выявляется при суправитальной окраске (без предварительной фиксации). Зернисто-нитчатая субстанция в различных видах ретикулоцитов отличается полиморфизмом. У самых молодых ретикулоцитов субстанция обильная и имеет форму густого клубка. В более зрелых клетках она выявляется в виде сеточки, отдельных нитей, зерен. В мазках, окрашенных по обычным гематологическим методикам, ретикулоциты серовато-розового цвета, полихлороматофильны (окрашиваются разными красителями). Определить количество ретикулоцитов можно при микроскопии специально окрашенных мазков.

Клиническое значение

Число ретикулоцитов в крови отражает регенеративные процессы костного мозга, и оценка его широко используется при различных анемиях.

Повышение количества ретикулоцитов служит критерием активации кроветворения и наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях, особенно в период криза (количество ретикулоцитов может быть 20–30 %), а также на фоне лечения анемии Аддисона – Бирмера витамином В12 (ретикулоцитарный криз – подъем числа ретикулоцитов на 4-8-й день лечения), в начале ремиссии при гипопластической анемии, при эффективной терапии анемий, при малярии, а также у новорожденных. При таких состояниях, как острый эритроцитомиелоз, метастазы рака в костный мозг, ретикулоцитоз не является показателем хорошей регенераторной способности костного мозга.

Снижение количества ретикулоцитов – показатель снижения интенсивности кроветворения. Наблюдается при апластической анемии, рецидиве В12-фолиеводефицитной анемии, железодефицитной анемии, при приеме цитостатических препаратов, лучевой терапии, заболеваниях почек.

Ядросодержащие клетки крови Лейкоциты являются ядросодержащими клетками крови. Они формируют в организме человека мощный кровяной и тканевой барьеры против микробной, вирусной и паразитарной инфекций, поддерживают тканевый гомеостазис и регенерацию тканей. Это высокоспециализированные клетки, обладающие различными функциями.

Нейтрофильные лейкоциты

Нейтрофильные лейкоциты участвуют в уничтожении проникших в организм инфекционных агентов, тесно взаимодействуя с макрофагами, Т– и В-лимфоцитами. Нейтрофилы секретируют вещества, обладающие бактерицидными эффектами, способствуют регенерации тканей, удаляя из них поврежденные клетки, а также секретируя стимулирующие регенерацию вещества. В цитоплазме лейкоцитов содержатся многочисленные мелкие гранулы трех типов.

Гранулы, дающие положительную реакцию на пероксидазу, представлены лизосомами, содержащими многочисленные энзимы: лизоцим, повреждающей клетку бактерий; катионные белки, нарушающие дыхание и рост микроорганизмов; протеазы и кислые гидролазы, позволяющие нейтрофилам легко переваривать фагоцитированные объекты.

Гранулы, не окрашивающиеся на миелопероксидазу, содержат лактоферрин, оказывающий бактериостатическое действие, транскобаламины I и III – переносчики витамина В12 в крови, лизоцим.

В гранулах третьего типа содержатся кислые глюкозаминогликаны, участвующие в процессах размножения, роста и регенерации тканей.

Базофильные лейкоциты

Базофильные гранулоциты крови и тканей (к последним относят и тучные клетки) выполняют множество функций: поддерживают кровоток в мелких сосудах, способствуют росту новых капилляров и трофике тканей, обеспечивают миграцию других лейкоцитов в ткани. Они способны к фагоцитозу, миграции из кровяного русла в ткани и передвижению в них. Базофильные лейкоциты участвуют в формировании аллергических реакций немедленного типа. Цитоплазма зрелых базофилов содержит гранулы неравных размеров. Базофилы могут синтезировать и накапливать в гранулах биологически активные вещества, очищая от них ткани, а затем секретировать их. Постоянно в клетке присутствуют:

1) кислые глюкозаминогликаны и гепарин – основной антикоагуляционный фактор;

2) гистамин – антагонист гепарина, укорачивающий время кровотечения, активатор внутрисосудистого тромбообразования. Гистамин стимулирует фагоцитоз, оказывает противовоспалительное действие на ткань.

Базофилы оказывают свои эффекты благодаря дегрануляции, т. е. выбросу содержимого гранул во внеклеточную среду.

Эозинофильные лейкоциты

Функции эозинофилов направлены на защиту организма от паразитарной гельминтной инфекции. Эозинофилы уменьшают концентрацию биологически активных соединений, возникающих при развитии аллергических реакций. Эозинофилы являются антагонистами тучных клеток и базофилов благодаря секреции соединений, предупреждающих длительное действие биологически активных веществ, выделяемых этими клетками. Эозинофилы обладают фагоцитарной и бактерицидной активностью. В цитоплазме присутствуют 2 типа гранул:

1) большие гранулы содержат специфический основной белок, обладающий свойством нейтрализовывать биологически активные вещества: гепарин, медиаторы воспаления;

2) маленькие гранулы содержат кислую фосфатазу и арилсульфатазу В, нейтрализующие «медленно реагирующую субстанцию аллергии».

Для человека характерно накопление эозинофилов в тканях, контактирующих с внешней средой, – в легких, желудочно-кишечном тракте, коже, урогенитальном тракте.

Моноциты-макрофаги (система фагоцитирующих макрофагов) обеспечивают фагоцитарную защиту организма от микробной инфекции. Образующиеся в макрофагах продукты метаболизма токсичны для многих паразитов человека. Макрофаги участвуют в формировании иммунного ответа организма и воспаления, усиливают регенерацию тканей и противоопухолевую защиту, участвуют в регуляции гемопоэза. Макрофаги фагоцитируют старые и поврежденные клетки крови. Макрофаги человека секретируют более 100 биологически активных веществ, что делает возможным их участие в регуляции гемопоэза, механизмов воспаления и т. п. Моноциты-макрофаги стимулируют фактор, вызывающий некроз опухоли (кахексин), обладающий цитотоксическим и цитостатическим эффектами на опухолевые клетки. Секретируемые макрофагами интерлейкин I и кахексин воздействуют на терморегуляционные центры гипоталамуса, повышая температуру тела.

Лимфоциты

Лимфоциты являются главными клеточными элементами иммунной системы организма.

Основные функции иммунной системы состоят в способности отличать свои антигены от чужих и образовывать к ним антитела. Эти функции распределены между двумя классами лимфоидных клеток – Т-лимфоцитами и В-лимфоцитами, которые развиваются независимо друг от друга после отделения от общей клетки-предшественника лимфопоэза. Т-лимфоциты и часть В-лимфоцитов находятся в постоянном движении по периферической крови и тканевым жидкостям организма.

Уровень функциональной дифференцировки лимфоцитов не всегда можно определить морфологически в световом микроскопе, морфологические отличия свойственны лишь иммунобласту – бласттрансформированному под влиянием антигена лимфоциту.

Т-лимфоциты делятся по меньшей мере на 4 субкласса:

1) киллеров, уничтожающих чужеродные или собственные клетки-мишени, на поверхности которых в комплексе с аллоантигенами (HLA) представлены чужеродные антигены (вирусы, гаптены);

2) хелперов Т-В, помогающих дифференцировке В-лимфоцитов в антителопродуцирующие клетки;

3) эффекторов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), выделяющих гуморальные медиаторы (лимфокины), которые изменяют поведение других клеток, вовлекая их в реакцию (фактор активации макрофагов, фактор ингибиции миграции макрофагов, хемотоксические факторы для нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, митогенный фактор и др.), действуют на проницаемость сосудов (кожнореактивный фактор, гистаминстимулирующий фактор), обладают противовирусной активностью (лимфотоксин, интерферон) и т. д.;

4) супрессоров, тормозящих иммунный ответ.

В каждой линии Т-клеток – киллеров, хелперов, эффекторов ГЗТ, супрессоров – обнаружены клетки памяти, обладающие способностью при повторном контакте с антигеном выполнять соответствующую функцию быстрее и интенсивнее, чем при первичном контакте с тем же антигеном.

Система В-лимфоцитов также подразделяется на множество мелких функциональных подсистем, способных реагировать с разными антигенами. Подобная специализация (клональная селекция) обеспечивает продукцию около миллиона различных антител. На часть антигенов (тимуснезависимых) В-лимфоциты отвечают самостоятельно, на большинство других (тимусзависимых) гуморальный иммунный ответ возможен при условии кооперирования В-клеток с Т-клетками (и макрофагами) и получения от Т-лимфоцитов (Т-хелперов) дополнительного сигнала. При первичной встрече с антигеном (первичный иммунный ответ) антителопродуцирующие потомки В-клеток синтезируют вначале (2–4 дня после иммунизации) антитела, относящиеся к JgM, затем (с 4-го по 7-й день), если доза антигена большая, происходит синтез антител класса JgG и в конечной стадии – JgA. Кроме того, при первичном ответе образуется клон В-лимфоцитов, обладающих иммунологической памятью. При вторичной иммунной стимуляции на большинство антигенов вырабатываются главным образом антитела класса JgG.

Радиоизотопными методами было подтверждено существование двух популяций лимфоцитов – короткои долгоживущих. Продолжительность жизни первых около 4 дней, вторых – в среднем около 170 дней.

Распределение Т– и В-лимфоцитов в периферической крови человека следующее: 25–30 % составляют В– и 60 % – Т-клетки. Лимфоциты, на которых не выявляются ни Т-, ни В-рецепторы, названы нулевыми, содержание которых в периферической крови около 10 %.

Таким образом, из приведенных данных видно, что лейкоциты крови выполняют в организме многообразные взаимосвязанные функции, направленные прежде всего на защиту организма от чужеродных влияний. При этом лимфоциты обеспечивают эту защиту, составляя основу специфического иммунитета, гранулоциты – благодаря главным образом фагоцитарной активности (фагоцитоз микробов и уничтожение их с помощью ферментов), моноциты – своим участием в иммунных реакциях, фагоцитозу и бактерицидному действию.

Длительность жизни лейкоцитов разнообразна и зависит от вида клеток. Полный цикл жизни гранулоцитов составляет 9-13 дней (5–6 дней они находятся в костном мозге, внутрисосудистый период – от нескольких часов до двух дней, остальная их жизнь проходит в тканях, где и осуществляются в основном их функции). Некоторые формы лимфоцитов (сохраняющие иммунологическую память) живут 300 дней. Есть и короткоживущая фракция лимфоцитов.

Количество лейкоцитов зависит от внешних факторов: времени суток (максимум – в вечернее время), сезона, изменения климата и метеорологических условий, приема лекарственных препаратов, влияния диагностических процедур, физиологического состояния организма (возраста, пола, беременности, фазы менструального цикла, приема пищи, воздействия тепла или холода, физических нагрузок) и от патологических изменений в организме.

Унифицированная методика подсчета лейкоцитов в счетной камере

Принцип

Подсчет лейкоцитов под микроскопом в определенном числе квадратов счетной камеры и расчет их количества в 1 л крови с учетом разведения крови и объема счетной камеры.

Реактив

3-5%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный для окраски ядер лейкоцитов несколькими каплями раствора метиленового синего. Раствор имеет голубой цвет, может длительно храниться.

Ход определения

В сухую пробирку наливают 0,4 мл реактива 1. Из пальца набирают 0,02 мл крови (можно использовать стабилизированную антикоагулянтом венозную кровь). Вытирают кончик пипетки, затем выдувают из нее кровь на дно пробирки, перемешивают, повторно набирая и выдувая смесь крови и реактива (пипетируя), маркируют пробирку и оставляют ее до момента счета. Хранить смесь крови с раствором уксусной кислоты рекомендуется не более 2–4 ч.

Кровь, разведенную в пробирке уксусной кислотой, тщательно перемешивают и заполняют ею счетную камеру. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин для оседания лейкоцитов. Не меняя горизонтального положения камеры, помещают ее на столик микроскопа и при малом увеличении (окуляр 10х, объектив 8х) подсчитывают лейкоциты в 100 больших квадратах. Лейкоциты считают по всей сетке в больших квадратах, не разделенных на малые квадраты и полосы, начиная с верхнего левого угла сетки. Для лучшего контрастирования затемняют поле зрения, опуская конденсор и закрывая диафрагму. Считают клетки, расположенные внутри квадрата и лежащие на любых двух линиях, чтобы дважды не подсчитывать одну и ту же клетку.

Расчет числа лейкоцитов проводят исходя из разведения крови (20), числа сосчитанных квадратов (100) и объема одного большого квадрата 1/250, так как сторона квадрата 1/5 мм, высота 1/10 мм:

X = (а х 250 х 20) / 100,

где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови;

а – число лейкоцитов в 100 больших квадратах;

20 – разведение крови;

100 – число больших квадратов;

250 – коэффициент пересчета на 1 мкл, так как объем одного большого квадрата равен 1/250 мкл.

Практически для расчета количества лейкоцитов в 1 мкл крови их число в 100 больших квадратах умножают на 50, а в 1 л – полученную величину умножают на 106.

X = a x 50,

где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови;

а – число лейкоцитов в 100 больших квадратах.

Примечание. При подсчете лейкоцитов неизбежна ошибка в 6–8 % случаев.

Причины ошибок

При большом количестве нормоцитов в периферической крови их засчитывают в число лейкоцитов (и лейкоциты, и нормоциты – ядросодержащие клетки). Для того чтобы правильно установить количество лейкоцитов, надо из общего числа ядросодержащих клеток крови вычесть количество нормоцитов.

Остальные причины ошибок аналогичны тем, которые возникают при подсчете в счетной камере количества эритроцитов.

Унифицированная методика подсчета лейкоцитов в гематологическом анализаторе

Принцип

Большинство счетчиков основано на кондуктометрическом методе. Клетки, находящиеся в растворе электролита, проходя через электрическое поле, изменяют сопротивление электрической цепи. Возникший импульс регистрируется счетным устройством с цифровой индикацией.

Кровь предварительно разводят и смешивают с каким-либо лизирующим эритроциты реактивом, например раствором уксусной кислоты или сапонином.

Специальное оборудование

Гематологический анализатор.

Реактивы и ход определения

Реактивы и ход определения – по инструкции, прилагаемой к прибору фирмой-производителем.

Нормативные величины

Количество лейкоцитов в зависимости от возраста: при рождении – 9,0–3,0 Г/л; 1 месяц – 5,0-19,6 Г/л; 1–3 года – 6,0-17,5 Г/л; 4–7 лет – 5,5-15,5 Г/л; взрослые – 4,0–9,0 Г/л.

Клиническое значение

В основе повышения количества лейкоцитов (лейкоцитоза) могут лежать различные патофизиологические механизмы, связанные с увеличением продукции, повышенной мобилизацией костномозгового резерва, а также перераспределением пристеночного пула. Перераспределенный лейкоцитоз обусловлен тем, что в сосудистом русле существует два пула лейкоцитов: пристеночный, или маргинальный, и циркулирующий. В связи с этим лейкоцитоз может развиваться вследствие поступления лейкоцитов из пристеночного пула или из органов, служащих для них депо. Это часто наблюдается при различных физиологических состояниях (физиологический лейкоцитоз):

1) физический лейкоцитоз (миогенные нагрузки);

2) пищеварительный лейкоцитоз (через 2–3 ч после приема пищи, особенно богатой белком);

3) беременность (особенно вторая половина);

4) эмоциональный стресс;

5) введение некоторых лекарственных препаратов (адреналин, кортикостероиды);

6) воздействие рентгеновских лучей и после физиотерапевтических процедур.

Наиболее частые причины патологического лейкоцитоза:

1) большинство острых инфекционных заболеваний (кроме брюшного тифа, бруцеллеза и вирусных инфекций);