Чтение онлайн

Флуориметрический метод анализа

Этот метод основан на явлении, которое называется флуоресценцией. Световая энергия, поглощенная атомами или молекулами, отдается ими в виде светового же излучения.

Спектр излучения флуоресценции многих веществ носит избирательный характер. Он не зависит от длины волны возбуждающего света. Это показывает, что спектр флуоресценции характеризует исследуемое вещество и является основой для обнаружения и идентификации этих веществ. Существуют многочисленные физико-химические факторы отклонения от пропорциональности энергии поглощения и энергии флуоресценции от концентрации исследуемого раствора. При практических определениях концентрации раствора по световой энергии требуется предварительное построение градуировочных кривых. Градуировочная кривая строится по результатам измерений флуоресценции растворов с известной концентрацией.

Флуоресцентные методы анализа, по сравнению с другими фотометрическими методами, обладают высокой чувствительностью. Для измерения оптического пропускания и флуоресценции предназначены приборы флуориметры.

Рефлектометрический метод анализа

Количественное определение содержания веществ на твердофазных носителях реактивов условно называется системами сухой химии. Измеряется интенсивность светового потока, отраженного от окрашенной поверхности носителя, которая зависит от концентрации исследуемой жидкой пробы. Определение изменения цвета окрашенной поверхности производится методом рефлектометрии. В качестве носителя сухих реагентов выступают реагентные полоски. Они наиболее широко используются для экспресс-анализа мочи и крови.

Сейчас на современном рынке лабораторных приборов представлена целая гамма принципиально новых клинических автоматических анализаторов сухой химии, которые работают без использования традиционных жидких реагентов.

Хемилюминесцентный анализ

Это один из люминесцентных методов анализа. Принцип метода состоит в том, что при реакции окисления происходит возбуждение молекул продуктов реакции и выделение световой энергии при возвращении их в основное состояние.

Частный случай хемилюминесценции – биолюминесценция. При биолюминесценции выделение световой энергии излучения происходит в результате окислительного процесса, который катализируется ферментами-люциферазами. Поскольку ферменты чрезвычайно избирательны, то биолюминесцентные методы очень специфичны.

Приборы, на которых производят хемилюминесцентный анализ, называются люминометрами.

Дозирующие устройства

Наиболее трудоемкой в лабораторных исследованиях является подготовка пробы к проведению анализа. Для сокращения трудозатрат, времени, повышения качества исследований и достоверности результатов в лабораторную практику внедряется широкий арсенал приспособлений, специализированных устройств и приборов пробоподготовки.

На качество и точность результатов лабораторных исследований существенное влияние оказывает аккуратное и точное выполнение операций дозирования.

Основные режимы дозирования:

1) прямое;

2) обратное;

3) многократное и режим разведения.

Прямое дозирование – весь забранный объем жидкости сбрасывается за один полный ход поршня. Этот режим подходит для дозирования водных растворов.

Обратное дозирование – в наконечник набирается несколько больший, по сравнению с дозируемым, объем жидкости.

Остающийся в наконечнике некоторый объем жидкости нивелирует погрешность, связанную с образованием пены или мениска. Этот режим подходит для очень малых объемов, а также для вязких и пенящихся жидкостей.

Многократное дозирование – повторяющиеся операции дозирования идентичных или различных объемов жидкости.

Режим разведения жидкости – в наконечник дозатора забирается первый объем, а затем перед забором второго создается воздушная подушка, и обе жидкости выливаются вместе.

По способу забора и выдачи доз дозирующие устройства подразделяются на пипеточные, клапанные и перистальтические дозаторы.

Пипеточные дозаторы

Это бесклапанные дозаторы. Забор и выдача пробы осуществляются через один и тот же наконечник дозатора. Забор дозирующей жидкости осуществляется в съемную насадку (наконечник). Пипеточные дозаторы нашли самое массовое применение в лабораторной практике.

Пипеточный диспенсер (степпер) осуществляет разовый забор дозируемого раствора в наконечник пипеточного дозатора. Затем через этот же наконечник осуществляется многократное пошаговое дозирование.

Пипеточный дилютер – через наконечник осуществляется последовательно забор различных жидкостей разных объемов. Через этот же наконечник выдается весь суммарный объем жидкости, находящейся в нем.

Дозаторы подразделяются по способу установки дозы на дозаторы с фиксированным объемом дозы и дозаторы с регулируемыми переменными объемами дозы. Первыми в мире регулируемыми пипетками были пипетки фирмы Labsystems.

Дозаторы подразделяются по количеству каналов дозирования на дозаторы одноканальные и многоканальные. Многоканальные дозаторы наиболее удобны при работе с микропланшетами и стрипами.

По способу управления дозаторы делятся на дозаторы с ручным приводом, автоматическим приводом и автоматическим приводом и автоматическим управлением – электронные дозаторы.

Новым этапом в развитии технологии дозирования явились электронные пипетки. Финская компания BIOHIT предлагает широкую гамму однои многоканальных дозаторов.

Электронные микродозаторы имеют преимущества в сравнении с механическими:

1) возможность замены нескольких обычных и специальных пипеток одной электронной, в том числе таких, как диспенсер, дилютер и миксер;

2) возможность дозирования в диапазоне от 0,2 до 25 000 мкл;

3) более высокая точность дозирования и воспроизводимость по сравнению с механическими пипетками;

4) легкость управления и небольшой вес позволяют в течение рабочего дня выполнять более 1000 манипуляций;

5) автоматическая калибровка;

6) возможность подзарядки от сети.

Центрифугирование

Для разделения неоднородных жидких сред применяется центрифугирование. Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле.

В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью.

Препаративное центрифугирование заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований. С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности.

Препаративные центрифуги можно подразделить на 3 основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги.

Центрифуги общего назначения обеспечивают центрифугирование с максимальной скоростью 8 тыс. оборотов в минуту. Они отличаются друг от друга емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами или другими контейнерами.

Центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены. Необходимо загружать четное число пробирок в ротор, размещая их симметрично.

Скоростные центрифуги развивают скорость 25 тыс. оборотов в минуту. Камера ротора снабжена системой охлаждения для предотвращения нагревания, возникающего при вращении ротора.

Препаративные ультрацентрифуги обеспечивают центрифугирование со скоростью до 75 тыс. оборотов в минуту.

К центрифугам специального использования относятся рефрижераторные центрифуги, центрифуги с нагревательной рубашкой и др.

Аналитическое центрифугирование применяется для изучения чистых препаратов макромолекул или частиц, например рибосом.

В данном случае используется небольшое количество материала. Седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала.

Аналитические центрифуги развивают скорость до 100 тыс. оборотов в минуту. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать.

Термостатирующие устройства

Для проведения лабораторных анализов необходимы термостатирующие устройства, которые могут быть в виде самостоятельных приборов или могут входить в качестве блоков в общую структура автоматических анализаторов.

Термостаты по принципу передачи тепловой энергии подразделяются на жидкостные, суховоздушные, сухие.

В жидкостных термостатах передача тепловой энергии от источника тепла к объекту термостатирования происходит через жидкую среду. Такие термостаты обладают высокими метрологическими характеристиками.

В лабораторной практике широкое распространение получили суховоздушные и сухие термостаты. В суховоздушных термостатах тепловая энергия передается за счет циркулирующего потока воздуха. В сухих термостатах передача тепловой энергии идет через массивный металлический блок к объекту: пробирке, колбе.

Выбор способа термостатирования определяется назначением, емкостью и формой термостатируемого объекта.

Перемешивающие устройства

С целью ускорения проведения реакции и улучшения воспроизводимости результатов исследования применяются перемешивающие устройства. Выбор типа движения и его характеристик от простейшего качающего и вращательного движения до сложного знакопеременного ротационного движения зависит от конкретного назначения устройства. Перемешивание не должно вызывать появления пены и пузырей, которые могут повлиять на результаты измерений.

В автоматических анализаторах перемешивание может осуществляться непосредственно струей впрыскиваемого в кювету автоматическим дозатором реагента.

Оценка биожидкости для исследования Перед исследованием нужно оценить вид сыворотки и другие биожидкости.

Гемолиз

Гемолизированная сыворотка и плазма непригодны для анализа многих компонентов (железа, ЛДГ, кислой фосфатазы, АсАТ, АлАТ, калия, магния, креатинина, билирубина, белковых фракций, осадочных проб и т. д.) в силу различных причин (более высокого содержания компонентов в эритроцитах и перехода веществ из них в сыворотку (плазму при гемолизе); химической или оптической интерференции гемоглобина в методах.

Видимый гемолиз распознается при пограничной концентрации гемоглобина 0,2 г/л. Уже при концентрации 1,0 г/л сыворотка плазма окрашивается в отчетливо красный цвет.

При наличии гемолиза в данной сыворотке исследование не проводится и запрашивается свежая биожидкость для анализа.

Билирубинемия Интерферирует в методах, основанных на фотометрических измерениях в коротковолновой области спектра видимого света (300–500 нм). Однако путем постановки холостых проб на сыворотку или разведения пробы (креатинин, изменения порядка добавления реактивов, экстракции, снижающих влияние билирубина) удается получить приемлемые результаты.

Липемия При липемии происходит помутнение сыворотки или плазмы вследствие высокого содержания хиломикронов после приема пищи, богатой жирами. Отчетливая мутность возникает при концентрации триглицеридов более 4,5 ммоль/л. Степень и характер мутности, вплоть до сливкообразного характера сыворотки, зависят от состава и концентрации протеинов в ней. В некоторых случаях липемия может быть скорригирована постановкой специальных холостых проб. Следует запрашивать свежую биожидкость для исследования, взятую натощак.

Мутность материала

Мутность материала для исследования может быть обусловлена ростом бактерий, попавших в пробу, особенно при длительном транспорте и неправильном хранении. В этих случаях материал непригоден для анализа.

Помимо указанных, критериями неприемлемости биоматериала для анализа в лаборатории являются:

1) отсутствие номера на пробирках, перепутывание направлений на анализ;

2) несоответствие объема собранной крови количеству добавляемого антикоагулянта;

3) использование неправильных, интерферирующих в определении данного компонента антикоагулянтов, например использование фторида натрия при взятии крови, предназначенной для определения мочевины уреазным методом;

4) неправильная транспортировка биожидкости (например, без охлаждения или в незамороженном виде).

Основные биохимические показатели крови

Лабораторная диагностика нарушений белкового обмена

Общий белок

Значение

В норме концентрация общего белка в сыворотке крови составляет 65–85 г/л.

Изменения концентрации общего белка могут иметь как абсолютный, так и относительный характер. Так, гипергидратация приводит к относительной гипопротеинемии, а обезвоживание – к относительной гиперпротеинемии.

Абсолютная гипопротеинемия развивается при:

1) недостаточном поступлении белков с пищей;

2) нарушении усвоения белков (снижение активности ферментов ЖКТ и др.);

3) понижении процессов биосинтеза белка (поражение паренхимы печени);

4) потере белка с мочой, кровью и др.

Абсолютная гиперпротеинемия (до 120 г/л и выше) встречается редко, наблюдается при миеломной болезни, макроглобулинемии, хронических воспалительных процессах.

Альбумин

Содержание альбумина в сыворотке крови является важнейшим показателем состояния белкового обмена.

В качестве унифицированного метода в клинической практике принят метод определения альбумина с красителями – бромкрезоловым зеленым и бромкрезоловым пурпурным.

Значение

В норме концентрация альбумина в крови 35–50 г/л.

Гиперальбуминемия встречается при избыточном введении альбумина, дегидратации организма.

Гипоальбуминемия имеет место при нарушении синтеза альбумина в печени, при недостатке белка в питании, недостаточном всасывании в кишечнике и потерях его в связи с поносами, при потерях белка через почки, через кожу, а также при повышенном катаболизме на почве тяжелого тиреотоксикоза, длительного приема гормонов и антиметаболитов.

Белковые фракции

При изучении белкового спектра крови в качестве унифицированного метода используется электрофоретическое разделение белковых фракций на пленках из ацетата целлюлозы и в геле агарозы.

Под электрофорезом понимают движение заряженных частиц в постоянном электрическом поле. Белки сыворотки крови, обладая определенным зарядом, двигаются в электрическом поле к аноду или катоду в зависимости от знака заряда. В зависимости от величины молекулярной массы и величины заряда, белки при использовании в качестве поддерживающей среды пленки из ацетата целлюлозы либо агарозных гелей разделяются на 5 основных фракций: альбумины, альфа-1-, альфа-2-, бетаи гамма-глобулины.

При проведении электрофореза можно выделить 6 основных этапов:

1) подготовка среды для электрофореза;

2) помещение среды в камеру для электрофореза и обеспечение электрического контакта с буферными кюветами;

3) нанесение пробы;

4) проведение электрофореза в заданном режиме напряжения и силы тока;

5) фиксация и выявление полученных фракций с помощью красителей;

6) количественная оценка выявленных фракций.

У здоровых людей содержание альбуминов составляет 56,3-68,8 %, альфа-1-глобулинов 3–5,8 %, альфа-глобулинов 6,9-10,5 %, бета-глобулинов 7,3-12,5 %, гамма-глобулинов 12,8-19,2 %.

Содержание альфа-1-глобулинов увеличивается при острых и хронических воспалительных процессах, некоторых злокачественных опухолях.

Содержание этой фракции снижается при дефиците бетаантитрипсина, гипоальфа-1-липид емии, в несвежих порциях крови.

Содержание альфа-2-глобулинов возрастает при острых и хронических воспалительных процессах, нефротическом синдроме, злокачественных опухолях, гемолизе, в стадии восстановления после термических ожогов.

Уровень альфа-2-глобулинов может снижаться при сахарном диабете и панкреатите.

Содержание бета-глобулинов увеличивается при первичных и вторичных гиперлипопротеинемиях, особенно II типа, моноклональных гаммапатиях. Уровень бета-глобулинов снижается при гипобеталипопротеинемиях.

Гипергаммаглобулинемия наблюдается при хронических инфекционных и аутоиммунных заболеваниях, гепатитах, циррозах печени; снижение наблюдается при врожденной гипогаммаглобулинемии или агаммаглобулинемии.

Коллоидно-осадочные пробы

Для изучения белкового обмена в КДЛ достаточно широко используются коллоидно-осадочные пробы.

Основными реакциями этого типа являются тимоловая и сулемовая пробы.

Тимоловая проба основана на помутнении смеси: при взаимодействии сыворотки с насыщенным раствором тимола в вероналоновом буфере. Определение степени мутности проводят фотометрически при длине волны 630–690 нм против рабочего реагента и выражают результат в единицах S-H.

В норме 0–4 ЕД S-H.

Более высокие цифры единиц помутнения могут косвенно указывать на диспротеинемию и характеризуют повышение содержания гамма-глобулинов.

Сулемовая проба основана на том, что сулема в присутствии мелкодисперсных растворов белков способна образовывать коллоидные растворы солей ртути. При нарушении дисперсности белковых фракций сыворотки крови происходит осаждение грубодисперсных частиц.

Результат выражают в количестве миллилитров сулемы, пошедшем на титрование.

Норма 1,6–2,2 мл сулемы. Как правило, сулемовая проба бывает положительной при токсических поражениях печени, циррозе, силикозе.

Лабораторная диагностика нарушений азотистого обмена

Если белки сыворотки крови денатурировать растворами кислот (например, ТХУ, фосфорно-вольфрамовой или фосфорно-молибденовой) и удалить центрифугированием, то в растворимом центрифугате остается ряд низкомолекулярных азотсодержащих соединений. Эта группа соединений получила название фракции остаточного азота.

В состав фракции остаточного азота входят азот мочевины (46–60 %), азот аминокислот (25 %), креатина и креатинина (7,5 %), мочевой кислоты (4 %), индикана, аммиака (0,5 %) и др.